WB过程中常见问题及处理方法课件.ppt

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WB的简介
WB即蛋白质印迹法(WesternBlot)。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。
基本原理通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色,分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。
三、WB的影响因素
步骤较多,任何一步都可能影响结果
1、电泳分离蛋白
蛋白抽提;
蛋白定量;
样品制备变性;
上样量;
电泳(电压、电流的大小,胶浓度、制胶)
3、封闭
封闭液的选择;
封闭条件优化;
……
5、抗体孵育
抗体及稀释液选择;
抗体稀释倍数优化;
抗体孵育时间;
……
四、注意事项

尽可能新鲜组织或蛋白
避免反复冻融
对于有些蛋白,加去磷酸化的(NaF)
尽量去除核酸,多糖,脂类等干扰分子(通过加入核酸酶或采取不同提取策略)
选择合适的裂解液
准确定量(BSA标准蛋白)
2、制胶
根据不同的蛋白大小,选择不同的浓度制胶。