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叶绿素荧光成像技术监测苗期小麦白粉病初探
单鼎城,赵亚男,张美惠马明慧韩志国刘伟
12, 12, 1, 1, 3, 1*,
范洁茹袁军海周益林
1*, 2, 1
中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室北京河北北方学院
(1.,, 100193;2.
农林科技学院张家口慧诺瑞德北京科技有限公司慧诺表型实验室北京
, 075000;3.(),, 100096)
摘要为探究叶绿素荧光成像技术在小麦白粉病监测应用中的可行性本研究对接种个不同浓度小麦白粉菌分
,6
生孢子的小麦幼苗离体叶段、一叶一心期幼苗和二叶一心期幼苗以及接种后不同时期进行叶绿素荧光成像测定,并
对导出的叶绿素荧光参数与病情严重度的关系进行分析。结果发现,接种不同浓度白粉菌分生孢子的小麦离体叶
段或幼苗的图像可以在一定程度上反映出小麦白粉病菌的侵染程度接种小麦白粉菌后第天
Fv/Fm。3,Fv/Fm
值随接种浓度的变化规律不明显但从接种后第天开始值随接种浓度的增加而下降且未接种的小麦幼
,5,Fv/Fm,
苗或离体叶段的值显著高于接种处理接种浓度最高的处理其值显著低于同时期其他
Fv/Fm,(5mg/mL)Fv/Fm
接菌处理小麦白粉病严重度与叶绿素荧光参数之间的相关性分析表明和与病害严重度均极显著
。,Fv/FmChlidx
负相关在此基础上分别建立了小麦离体叶段一叶一心幼苗及二叶一心幼苗的基于参数或的病
,,、Fv/FmChlidx
害严重度估计模型对模型的拟合效果进行比较发现基于或的病害估计模型其或比较
。,Fv/FmChlidxRMSER2
接近因此叶绿素荧光参数或用来估计苗期小麦白粉病发生程度是可行的本研究为叶绿素荧光
,Fv/FmChlidx。
成像技术在小麦白粉病监测预警中的应用奠定了理论基础,具有一定的应用前景。
关键词小麦白粉病叶绿素荧光成像技术植物病害监测
; ;
中图分类号文献标识码
: : A DOI: .2021446
A preliminary study on the monitoring of wheat powdery mildew at seedling
stage based on chlorophyll fluorescence imaging technology
,,
SHAN Dingcheng12, ZHAO Yanan12, ZHANG Meihui 1, MA Minghui 1, HAN Zhiguo3, LIU Wei 1*,
FAN Jieru1*, YUAN Junhai 2, ZHOU Yilin1
( Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests,Institute of Plant Protection,
Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China; of Agriculture and
Forestry Science and Technology,Hebei North University,Zhangjiakou 075000,China;
Laboratory,PhenoTrait Technology Co.,Ltd.,Beijing 100096,China)
Abstract To investigate the feasibility of applying chlorophyll fluorescence imaging technology for monitoring
wheat powdery mildew,chlorophyll fluorescence measurements were performed on detached leaf segments of
wheat seedlings,one-leaf wheat seedlings and two-leaf wheat seedlings inoculated with six different concentrations
of Blumeria graminis (Bgt)spores,and the relationships between the chlorophyll fluorescence
parameters and disease severity were results demonstrated that Fv/Fm-images of wheat leaf
segments or seedlings inoculated with different concentrations of Bgt spores could reflect the infection degree of
Bgt to a certain Fv/Fm values showed no obvious change with inoculum concentrations on the 3rd-day
after inoculation,but from the 5th-day,the Fv/Fm values showed a downward trend with increasing inoculum
Fv/Fm values of wheat seedlings or detached leaf segments in the non-inoculated control
treatment were significantly higher than those in the inoculated treatments,and the Fv/Fm values in the treatment
收稿日期修订日期
: 2021-08-16 : 2022-04-06
基金项目:国家自然科学基金();国家重点研发计划()
通信作者 刘伟31901826范洁茹2016YFD0300700
*E-mail:******@;******@
·001·2022
group with the highest inoculum concentration(5 mg/mL)were significantly lower than those of other treatments
in the same analysis of the correlations between the disease severity and chlorophyll fluorescence
parameters showed that Fv/Fm or Chlidx were significantly negatively correlated with disease this
basis,disease severity estimation models based on Fv/Fm or Chlidx were the fitted
2
models,it was found that the values of RMSE or R of the disease estimation models were relatively close based on
Fv/Fm or Chlidx for detached wheat leaf segments,one-leaf wheat seedlings and two-leaf wheat seedlings,
,it is feasible for chlorophyll fluorescence parameters(.,Fv/Fm or Chlidx)to be used
for estimating the severity of wheat powdery mildew at seedling study laid a theoretical foundation and
had a prospect for application of chlorophyll fluorescence imaging technology to the monitoring and early warning
of wheat powdery mildew.
Key words wheat powdery mildew; chlorophyll fluorescence imaging technology; plant disease monitoring
小麦白粉病是由禾布氏白粉菌小麦专化型侵染后的麦穗损害程度和病害分布情
um culmorum
引起的气传性病况这些研究均表明利用叶绿素荧光成像技术来
Blumeria graminis 。,
害,当小麦叶片受到白粉菌侵染后,叶绿素含量会显监测植物病害胁迫是可行的。
著下降,且感病后不同时间和严重度下叶绿素含量在小麦白粉病方面,利用激光诱导叶绿素荧光
的变化有所不同[]因此通过叶片中叶绿素含量监测小麦
1-2。,(laser-induced chlorophyll fluorescence)
的变化可以了解植物所受病害胁迫的程度。但传统叶片受白粉病侵染的程度已有研究报道[11],而叶绿
上,叶绿素含量的测量主要采用紫外分光光度法,该素荧光成像技术在小麦白粉病监测研究中鲜有报
方法操作繁琐,而叶绿素荧光技术可以直接、快速地道。为了探究叶绿素荧光成像技术在小麦白粉病监
通过叶绿素荧光反映出叶绿素的变化以此作为生测中的可行性本研究在室内对接种个不同浓度的
,,6
物胁迫检测的依据。近年来,随着叶绿素荧光测定小麦白粉病菌分生孢子的小麦离体叶段、一叶一心幼
和成像技术的进步,尤其是叶绿素荧光成像系统的苗及二叶一心幼苗进行叶绿素荧光测定,初步明确图
开发,提出了一种从宏观上获取植物荧光的方式,在像以及图像参数与病情严重度之间的关系,为该技术
获取荧光参数的同时也获得了快速、直观和精确的在小麦白粉病监测中的应用提供理论依据。
图像信息这使得叶绿素荧光成像技术克服了传统
,材料与方法
1
荧光仪有限点测量的缺点,因而逐渐被广泛应用。
陈兵等[]对棉花黄萎病胁迫下的供试材料
3(Verticillium wilt)
棉花叶片进行叶绿素荧光检测结果发现利用叶绿供试小麦品种为京双高感小麦白粉病
,‘16’()。
[]小麦白粉病菌菌株为混合菌株由中国农业科学院
素荧光监测棉花黄萎病是可行的;许培磊等4的研,
究发现葡萄霜霉病菌侵染离植物保护研究所小麦白粉病组提供多功能植物光
,Plasmopara viticola;
体山葡萄叶片后其光系统活性合表型测量系统荷兰
Vitis amurensis3d,PlantExplorerPro(PhenoVa-
就发生了显著变化等[]利用叶绿素荧光技公司由慧诺表型实验室提供
;Mandal5tion)。
术检测发现轻度感染霜霉病与重度染病的圆苞车仪器相关参数分别为相机传
,PlantExplorerPro:
前叶片的值相较于健康叶感器类型为相机分辨率为万像素单张叶
Plantago ovataFv/FmCCD,130,
片分别降低了和已有研究发现绿素荧光图像获取时间为激发光强
%%。,20~1 000μs,
利用叶绿素荧光成像技术可以实现烟草感染辣椒轻度在处为2在
25cm1 500~6 000μmol/(m·s),
斑驳病毒或感染黄瓜炭处为2且强度可
(pepper mild mottle virus)60cm800~3 500μmol/(m·s),
疽菌后感病程度检调成像面积为
Colletotrichum orbiculare。40cm×53cm。
测[]等[]利用叶绿素荧光成像技术对感染黄试验方法
6-7;
龙病菌的柑橘叶片进行诊试验设置和接菌浓度梯度处理
Candidatus
断诊断准确率最高可达等[]利本试验分别选取小麦幼苗期离体叶段一叶一
,97%;Bauriegel9-10、
用叶绿素荧光图像技术分析了受黄色镰孢心期幼苗两叶一心期幼苗进行叶绿素荧光成像监
Fusari-、
卷第期单鼎城等叶绿素荧光成像技术监测苗期小麦白粉病初探
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测。各时期小麦培养条件基本一致。各时期小麦均要是将小麦离体叶段的培养皿、一叶一心幼苗和二
在光周期条件下的温叶一心幼苗的盆以及背景杂物全部隐去只在图像
(18±1)℃,L∥D=16h∥8h,
室或培养箱内培养中留下清晰的离体叶段或麦苗然后利用模
。。ROI
小麦幼苗离体叶段的准备将京双小麦品块将植物图像进行分割分别导出分割图像或者全
:‘16’,
种种植在用玻璃罩罩起的塑料盆内防止污染待图像的叶绿素荧光图像参数通过
(),。Data Analysis
小麦第叶完全展开时在无菌条件下将叶片剪成数据分析软件分析处理可以得到暗适应下
1,Software
长约的叶段整齐摆放入方形最大光化学量子产量非光化学淬灭系数
4cm,10cm×10cm(Fv/Fm)、
培养皿中的水琼脂培养基上每皿个叶段光化学淬灭系数叶绿素指数
,15。(NPQ)、(qP)、(Chlidx)
一叶一心期和两叶一心期小麦幼苗的准备将等个参数
:4。
京双小麦品种种植在用玻璃罩罩起的塑料盆数据分析
‘16’
内每盆按照一字形种株麦苗待小麦苗长至病菌分生孢子不同接种浓度梯度下小麦离体叶
,“”10,
一叶一心及两叶一心时备用。段、一叶一心幼苗、二叶一心幼苗的叶绿素荧光参数
孢子悬浮液的准备将新鲜的重为的多因子方差分析和差异显著性分析分别
:4、8、12、Fv/Fm
和的孢子粉分别置于喷壶中倒入采用软件的和
16mg20mg,SAS()PROC GLMPROC
电子***化液涡旋振荡混匀后进行喷雾模块完成接种后第天的离体叶
4mL,15s,ANOVA。5、7、9
接种。段、一叶一心期幼苗、二叶一心期幼苗的小麦白粉病
接菌处理各处理均设置个浓度的白粉病菌病情严重度与其对应的叶绿素荧光参数值之间的相
:6
分生孢子悬浮液用电子***化液配制的对照关性分析采用软件的模块完成
,0()、1、SASPROC CORR。
的小麦白粉病菌分生孢子悬浮液利用软件的模块建立不同时期下
2、3、4、5mg/mL,SASPROC REG
其中离体叶段上每个接菌浓度设置个重复基于和的小麦白粉病严重度估计模
4(4Fv/FmChlidx
皿一叶一心两叶一心期小麦苗上每浓度设置型并利用决定系数和均方根误差来
),、3,(R2)(RMSE)
个重复盆每个重复喷分生孢子悬浮液检验拟合程度
(3),3mL,。
在无菌操作台内按浓度梯度由低到高接菌然后将
,结果与分析
各处理随机排列置于培养箱或温室内2
(18±1)℃
培养白粉病菌分生孢子不同接种浓度下小麦离体
。
病害调查:在进行叶绿素荧光成像检测的当天,叶段的叶绿素荧光图像变化
逐个对叶片进行白粉病发病情况调查按病斑面积在接种白粉病菌分生孢子后的第天对
, 3、5、7、9
占叶片面积的百分率记录严重度并计小麦离体叶段进行叶绿素荧光图像采集获取
(0~100%),,Fv/
算每个浓度处理的平均严重度图像图图像中的荧光信息分布比
。Fm(1)。Fv/Fm
叶绿素荧光图像采集和处理较均匀分生孢子的接菌处理随着接菌时
,1mg/mL
分别于接菌后的第天和第天利用间的延长没有明显的差异表明在病菌分生孢子浓
3、5、79,
多功能植物光合表型测量系统对不度低时离体叶段的荧光强度保持在一个相对稳定
PlantExplorerPro,
同时期以及接种不同浓度病菌分生孢子的小麦离体的范围而分生孢子处理的荧
;2~5mg/mLFv/Fm
叶段或幼苗进行叶绿素荧光成像检测为了减少干光信息在小麦白粉病显症之前接菌后第天染
((3),
扰提高测量的准确性盛放参试材料的托台均用黑病叶段的叶表面荧光信息变化相对较小
,,Fv/Fm;
色幕布包裹开始检测之前参试材料需在无光的在显症初期接菌后第天开始变化且在
),,Fv/Fm(5),
植物测量室内暗适应测量结束后文件保存接菌后第天和第天此时叶片已明显出现症状
20min,79()
为文件格式表现出一定的差异尤其是在病斑侵染严重的区域
DAT。,,
利用系统自带的荧光信息显示为红色染病叶段的图像强度
PlantExplorerProData Analy-,Fv/Fm
分析软件对相应的图像进行分析首先分布会随着发病程度的增加而出现明显红色加深的
sis Software,
利用功能将不发叶绿素荧光的背景去除主变化
Mask,。
·201·2022
图接种不同浓度白粉菌分生孢子后小麦离体叶段的图像
1 Fv/Fm
Fv/Fm-images of detached leaf segments of wheat inoculated with Blumeria graminis (Bgt)spores with
different concentrations
小麦不同生长时期和白粉病菌分生孢子不同 苗二叶一心幼苗的叶绿素荧光参数的多
、Fv/Fm
接种浓度梯度下的比较因子方差分析结果表明分生孢子浓度对
Fv/Fm,Fv/Fm
对不同接种浓度下小麦离体叶段一叶一心幼值的影响均达极显著水平接种后天数
、(P<);
卷第期单鼎城等叶绿素荧光成像技术监测苗期小麦白粉病初探
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仅对小麦幼苗离体叶段有显著影响而对增加而下降图
Fv/Fm,(2)。
一叶一心幼苗和两叶一心幼苗的无显著影通过对离体叶段一叶一心幼苗二叶一心幼
Fv/Fm、、
响接种浓度和接种后天数两因子交互作用对离体苗在不同接菌浓度下第天时的荧光参数
;5、7、9
叶段和一叶一心幼苗无显著影响而对两的差异显著性分析发现分生孢子浓度对
Fv/Fm,Fv/Fm,
叶一心幼苗影响达到显著水平表不同时期小麦叶绿素荧光参数值有一定
Fv/Fm(1)。Fv/Fm
接种白粉病菌分生孢子后的第天时离体叶影响除一叶一心幼苗用孢子悬浮
3,,1~2mg/mL
段一叶一心幼苗以及两叶一心幼苗的值随液处理时其值与未接种对照处理没有显
、Fv/FmFv/Fm
接种浓度的变化规律均不明显而在接种后第著差异外其他处理的值均显著低于对照
,5、7,Fv/Fm
和天时在个时期下值均随接种浓度的表
9,3Fv/Fm(2)。
表小麦不同生长时期和白粉病菌不同接菌浓度下的多因子方差分析)
1 Fv/Fm1
Table 1 Multi-factor variance analysis of Fv/Fm at different stages of wheat and different inoculation concentrations of
Blumeria graminis spores
变异来源离体叶段
Detached leaf segment
Source of variationdf SS MS F P
接菌浓度
(A) Inoculation concentration gradient 5 3 46 < 1
接菌后天数
(B) Days after inoculation 2 79 4 < 1
A*B 10 34 034 5
误差
Error 54 8 034
总变异
Total variation 71 3
变异来源一叶一心期
One-leaf seedling stage
Source of variationdf SS MS F P
接菌浓度
(A) Inoculation concentration gradient 5 5 2
接菌后天数
(B) Days after inoculation 2 3 65 2
A*B 10 2 52 9
误差
Error 36 69
总变异
Total variation 53
变异来源两叶一心期
Two-leaf seedling stage
Source of variationdf SS MS F P
接菌浓度
(A) Inoculation concentration gradient 5 9 9 1
接菌后天数
(B) Days after inoculation 2 35 18 2
A*B 10 4 64 7
误差
Error 36 28
总变异
Total variation 53
自由度总平方和均方统计值显著性
1)df:;SS:;MS:;F:F;P:。
df:Degree of freedom;SS:Sum of squares;MS:Mean square;F:The value of Fstatistics;P:The significance.
表接种不同浓度白粉病菌分生孢子条件下叶绿素的)
2 Fv/Fm1
Table 2 Fv/Fm values of chlorophyll under different inoculation concentrations of Blumeria graminis spores
分生孢子接种浓度Fv/Fm
/mg·mL-1离体叶段一叶一心期两叶一心期
Inoculation concentrations of spores
Detached leaf segmentOne-leaf seedling stageTwo-leaf seedling stage
CK(0)( 0± 9)a( 9± 6)a( 8± 9)a
1( 4± 4)b( 2± 7)ab( 4± 5)b
2( 3± 9)bc( 9± 1)ab( 2± 5)b
3( 6± 3)c( 8± 7)b( 7± 1)b
4( 5± 5)bc( 8± 3)b( 5± 4)b
5( 2± 2)d( 5± 6)c( 2± 8)c
同列中相同字母表示经邓肯氏多重比较在水平上没有显著差异
1)。
The same letters in the same column indicate insignificant difference at by Duncan’s multiple comparison.
·401·2022
图接种不同浓度白粉病菌分生孢子后不同天数的箱线图
2 Fv/Fm
Fv/Fm boxplot of different days after inoculation with different concentrations of Blumeria graminis spores
小麦白粉病病情严重度与荧光参数的相 小麦白粉病病情严重度与叶绿素荧光参数的
关性关系模型
通过分析接种后第天的离体叶段一叶在相关性分析的基础上选取接种后第
5、7、9、 ,5、7、9
天的叶绿素荧光参数和分别建立不
一心幼苗、二叶一心幼苗的小麦白粉病病情严重度Fv/FmChlidx,
与其对应的叶绿素荧光参数值表的关系发现同时期下基于/和的小麦白粉病严重
(3),FvFmChlidx
随接菌浓度的升高有逐渐降低趋势度估计模型(表)。结果可以看出,两个参数在离
Fv/Fm、Chlidx;5
体叶段、一叶一心幼苗期、两叶一心幼苗期所建模型
而接菌浓度越高,病情严重度越大;和随接
qPNPQ拟合效果均达到极显著水平但在两叶
菌浓度变化规律不明显(P<),
。一心幼苗期所建模型拟合效果相较离体叶段和一叶
进一步对小麦白粉病病情严重度与其对应的
一心幼苗期所建模型略差
叶绿素荧光参数之间的相关性表分析可以看。
(4)通过对基于两个参数所建模型拟合效果图
(3)
出,所选叶绿素荧光参数/和与病情
FvFmChlidx比较发现,在同一时期基于叶绿素荧光参数/
严重度之间均存在极显著负相关关系且两个参FvFm
,或所建模型的拟合度相似所建病害估计模
Chlidx,
数在离体叶段和一叶一心幼苗期与病情严重度型的基本相等且同一时期分别基于和
R2,Fv/Fm
之间的相关系数明显高于两叶一心幼苗期所建模型的理论值和实际观察值之间的均方
。qPChlidx
在离体叶段和两叶一心期与病情严重度显著负根误差比较接近因此叶绿素荧光参数
(RMSE),,
相关而在一叶一心幼苗期与病情严重度未达到或者用来估计苗期小麦白粉病病情
,Fv/FmChlidx
显著相关性。发生情况是可行的。
卷第期单鼎城等叶绿素荧光成像技术监测苗期小麦白粉病初探
485:·501·
表小麦不同生长时期和不同接菌浓度下小麦白粉病病情严重度及荧光图像参数的动态变化)
3 1
Table 3 Dynamic changes of disease severity of wheat powdery mildew and fluorescence image parameters at different
wheat growth stages and inoculation concentrations
接菌浓度第天
生长时期/5
mg·mL-1The 5th day
Growth stage
ConcentrationFv/Fm NPQ Chlidx qP DS
离体叶段
1 ± 6 ± 7 ± 1 ± 5 ±
Detached leaf segment2 ± 4 ± 9 ± 6 ± 3 ±
3 ± 0 ± 19 ± 9 ± 4 ±
4 ± 9 ± 7 ± 6 ± 0 ±
5 ± 7 ± 6 ± 6 ± 7 ±0