文档介绍：该【§2.2 双波长和三波长分光光度法课件】是由【luyinyzhi】上传分享，文档一共【33】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【§2.2 双波长和三波长分光光度法课件】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。第二节双波长和三波长分光光度法
双波长分光光度法是在传统的单波长分光度法的基础上发展起来的。单波长分光光度法要求式样本身透明,不能有混浊,如果是试样溶液在测量过程中逐渐产生浑浊便无法正确测定。对于吸收峰相互重叠的组分或背景很深的试样分析,也很难得到准确的结果。
双波长分光光度法的建立,在一定程度上克服了单波长法的局限性,扩展了分光光度法的应用范围,在选择性、灵敏度和测量精密度等方面都比单波长法有进一步的改善和提高。

对于混浊试样或成分复杂、背景吸收较大的试样,采用经典的分光光度法就难以找到合适的参比溶液来消除其干扰。若采用双波长分光光度法,将λ2选择在被测组分的最大吸收波长处,λ1选择在基本无吸收的波长处,这样可以从分析波长的信号中减去参比波长的信号,消除了干扰,大大提高了方法的选择性和灵敏度。
单组分的分析
测定波长λ2和λ1通常选用被测组分的最大吸收波长和等吸光点波长进行测定。若无等吸光点或等吸光点无法准确确定,可以选用被测组分的最大吸收波长和该组分吸收光谱曲线下端的某一波长作为测定波长。
(2)双组分中某一组分的分析
试样中含有A、B两组分,组分B干扰组分A的测定。若采用双波长分光光度法,可不分离B而直接测定A的含量。
等吸光度波长法
为了消除干扰组分B的吸收,分析波长λ1选择在组分A的最大吸收峰或它的附近,参比波长λ2用作图法确定,如下图所示。在组分A的λ2处作一垂直于X坐标的直线,该直线与干扰组分B
因
所以
该式表明,此时测得的A与干扰组分无关。
(b)系数倍率法
当干扰组分B的吸收光谱曲线无吸收峰,仅出现陡坡,不存在吸光度相等的两个不同波长,如下图所示。在这种情况下,采用系数倍率法。利用双波长分光光度计本身的电子线路,选择被测组分吸收差值大的波长进行测定。用差分放大器可获得混合试样在波长λ2和λ1处的差示信号S:
式中,K2和K1分别为在λ2和λ1处的放大系数;组分A和B在λ2和λ1处的吸光度分别为
调节仪器中的信号放大器,使干扰组分B在波长λ2和λ1处的信号相等,由此得系数倍率K为:
则上式为:
该式表明,干扰组分消除,信号S与被测组分的吸光度值有关,从而可以测定其含量。

双波长分光光度计采用两个单色器,如图所示。光源的光束经两个单色器后分别产生波长为λ1和λ2的两单色光,由切光器使两单色光以一定的时间间隔交替通过同一吸收池,并被光电倍增管交替接收,测得吸光度差A。当光强度为Io的两单色光λ1和λ2交替通过同一吸收池时,根据比耳定律,对λ1波长:
双波长分光光度计光路示意图
,2、,,,。
对λ2波长:
式中,△As1和△As2为背景吸收,若λ1和λ2很相近,可视为相等。因此通过吸收池后的光强度差为:

双波长分光光度法的特点具有如下的特点:
可进行浑浊试样的分析。
通过适当的波长组合,可进行双组合或三组合混合物的同时测定。
当波长相差1~2nm时,使双波长同时扫描,可记录一阶导数光谱。
采用一波长固定,另一波长扫描,记录吸收光谱。可消除浑浊背景的影响。
采用双笔记录器,可记录溶液中发生的两种现象。
从原理上讲,单波长法(单光束和双光束)和双波长法的不同之处是:双波长用二个单色器,得到二个不同波长的单色光,测量的是两个波长处的吸光度差,使用一个吸收池,取消了参比池。

(1).双组分同时测定
有些化学性质相似的元素,可在一定条件下同时与一种显色剂反应,生成的有色配合物吸收光谱相互重叠,相互干扰测定。由于它们的化学性质相似,一般难于找到合适的掩蔽剂来消除干扰影响。采用双波长法,通过适当的波长组合,就能顺利地消除干扰影响,实现两组分同时测定。
在有机化学、生物化学和药物化学中,广泛应用双波长法作异构体或类似物的同时测定。
(2).单一组分测定中干扰组分影响的消除
当待测组分和共存组分吸收光谱重叠,严重干扰待测组分时,采用双波长法可消除干扰组分的影响,提高测定的准确度。
(3).双波长法作背景吸收和浑浊干扰的消除
在分光光度法分析中,有些显色剂或显色体系,在测定条件下,由于背景吸收较大产生的误差显著的降低了测定的准确度,并使方法的测定受到限制。
用双波长法能在一定程度上消除浑浊背景的干扰,进行混浊样品分析。在生物化学和临床医学上,浑浊样品较多,双波长法应用更为广泛。
式中,m和n分别表示(2-1)和(3-2)的数值。1、2和3分别为待测物在三波长处的摩尔吸光系数;C为待测物的摩尔浓度;b为光程。方程中的系数可预先求得,A值与待测物浓度成正比,因而可通过曲线求出样品中待测组分的含量。
从上图可知,如选择的三个波长相应于吸收曲线上三点处于一条直线上,则测得的A值为零。因此,当干扰组分的吸收光谱为一直线(如浑浊产生的干扰),则在任选的三个波长处测定,测得的值与干扰物浓度无关,如果干扰物为一吸收曲线,只要在曲线上找到处在一条直线上的三点,在此三点相应的波长处测定,由于干扰物在此三波长处的值为零,故测得的只与待测组分的浓度有关。