文档介绍：核酸分子杂交和核酸探针检测
核酸分子杂交的分子生物学基础
核酸分子杂交的方法
核酸分子杂交及探针技术的应用
核酸杂交的分子生物学基础
变性(denaturation)和复性(renaturation) 是双链核酸分子的二个重要物理特性。也是核酸研究中经常引用的术语。双链DNA,RNA双链区,DNA: RNA杂种双链(hybrid duplex)以及其它异源双链核酸分子(heteroduplex) 都具有此性质。
DNA的变性:
指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。确切地就是维持双螺旋稳定性的氢键和疏水键的断裂。断裂可以是部分的或全部的,是可逆的或是非可逆的。DNA变性不涉及到其一级结构的改变。凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件,如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰***等,均可破坏双螺旋结构引起核酸分子变性。变性能导致DNA 以下一些理化及生物学性质的改变。
2 . DNA的复性:
指变性DNA 在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过程称之为" 退火"(annealing)。这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成(见后)。DNA的复性不仅受温度影响,还受DNA自身特性等其它因素的影响。
3. 核酸分子杂交
分子杂交(简称杂交,hybridization)是核酸研究中一项最基本的实验技术。其基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质,使来源不同的DNA(或RNA)片段,按碱基互补关系形成杂交双链分子(heteroduplex)。杂交双链可以在DNA与DNA链之间,也可在RNA与DNA链之间形成。杂交的本质就是在一定条件下使互补核酸链实现复性(加热或碱处理)使双螺旋解开成为单链,因此,变性技术也是核酸杂交的一个环节。
DNA/RNA核酸分子杂交
4. 核酸探针
若杂交的目的是识别靶DNA中的特异核苷酸序列,这需要牵涉到另一项核酸操作的基本技术─探针(probe)的制备。探针是指带有某些标记物(如放射性同位素32P,荧光物质异硫***酸荧光素等)的特异性核酸序列片段。若我们设法使一个核酸序列带上32P,那么它与靶序列互补形成的杂交双链,就会带有放射性。以适当方法接受来自杂交链的放射信号,即可对靶序列DNA的存在及其分子大小加以鉴别。核酸分子杂交作为一项基本技术,已应用于核酸结构与功能研究的各个方面。在医学上,目前已用于多种遗传性疾病的基因诊断(gene diagnosis),恶性肿瘤的基因分析,传染病病原体的检测等领域中,其成果大大促进了现代医学的进步和发展。
5 核酸分子杂交的种类
A. Southern blot杂交
将一定量的DNA样品用适当的限制性内切酶切割成不同长度的DN***段,然后在琼脂糖凝胶上进行电泳分离,如加样量相等,酶解适当,则在用溴化乙锭染色时,应显示长度及亮度均相等的DNA拖带。电泳后的凝胶须经碱变性处理,使DNA解离成单链,然后用毛细管虹吸法或电转移法,使凝胶上的单链DN***段,按凝胶上相同的位置转移到***纤维素膜或尼龙膜,经适当洗涤、凉干后,在80℃烤箱中加温2小时,即可用于杂交。用于检测DNA的已知探针,一般由带有该片段的细菌质粒中制备。纯化的探针DNA一般用放射性同位素32P或生物素、***配基等标记。杂交前探针必须加温至100℃变性处理。杂交后的膜在暗盒中进行放射自显影后,即在一定的位置显示同标记探针特异地结合的阳性DNA条带。Southern blot杂交法可检测癌基因的存在及其扩增,也可检测抑癌基因的杂合性丢失。
B. Northern blot杂交
Northern blot杂交的原理与Southern blot杂交基本相同。所不同处在于,RNA远不如DNA稳定,很容易被RNA酶降解,而RNA酶不仅广泛存在,而且加热至100℃也不能使其灭活,所以在操作RNA时所用的一切器皿和溶液都必需经过严格的消除RNA酶的处理。另外,RNA的电泳必须在含甲醛或乙二醛的变性凝胶中进行。Northern blot杂交主要应用于检测癌基因或基他肿瘤相关基因的过度表达,也可检测抑癌基因的低表达或不表达。