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实验一、减数分裂(3学时)
一、实验目的
了解高等植物的花粉减数分裂过程,观察其染色体的动态变化,领会减数分裂过程在遗
传学基本理论中的意义。
二、实验原理
减数分裂的定义
减数分裂各时期的主要特征:前期I:细线期——染色体成细长的线状,核膜完整;偶
线期——同源染色体开始配对;粗线期——非姊妹染色单体间可能发生交换;双线期——出
现交叉;终变期——交叉端化,染色体最为短粗,是计数染色体最佳的时期。
中期I染色体排列在赤道板上,后期I同源染色体分开移向两极,末期I形成两个子细
胞
第二次减数分裂同有丝分裂
遗传学意义:1)遗传2)变异粗线期及后期I可产生变异
三、用具及药品
显微镜、解剖针、盖玻片、载玻片、镊子、醋酸洋红、卡诺固定液、乙醇
四、实验步骤
1、取材和固定
培养大葱,当花蕾呈嫩绿色表面光滑时进行取材,时间是上午7-10时,将花序总
苞剥去,立即投入到卡诺固定业中固定4-24小时,经95%乙醇和70%乙醇各冲洗30分钟,
然后换入70%乙醇中保存,4度下可保存一年以上。
2、染色
取发育程度不同的花序,每个花序按上、中、下不同部位分别镊取2-3个花蕾放于
载片上,用解剖针剥出花药,加1滴醋酸洋红染色液,用解剖针反复挤压花药,使花粉母细
胞进入染液中,染色5-10分钟。较大的花药可以用刀片横切成3-4段,然后再挤压。
3、压片
将载玻片放在酒精灯上微烤几次,在材料处加上盖玻片覆以吸水纸,用拇指均匀用
力压片。
4、观察
五、作业
绘出所观察的花粉母细胞减数分裂各个时期的分裂相。
六、注意事项
1、操作过程尽量减少花粉母细胞的遗失
2、注意区分第一次减数分裂和第二次减数分裂的细胞(第一次细胞为一个大的圆形的
细胞,第二次为两个长椭圆型的细胞)
3、区分花粉母细胞和花药壁细胞(后者为半月型细胞核均匀)
4、前期、中期区别——核膜有无,后期、末期区分——细胞板是否形成
需要配制药品:
实验二、染色体组型分析(6学时)
一、实验目的
学****染色体组型分析的方法,了解染色体组型分析的意义
二、实验原理:.
染色体组(genome):一个二倍体生物配子所含有的全套染色体,称为一个染色体
组。而染色体组在细胞分裂中期的表型称为染色体组型或称核型,包括染色体数目(即基数)、
形态、大小、着丝点位置及副缢痕、随体的有无等特征。
染色体组型分析就是通过对染色体标本和其照片进行测量、对比分析、配对分组、
排列,对组内各染色体的形态进行测量、描述,从而阐明生物染色体组成的过程。
染色体组型分析的意义:
1)分析未知生物的染色体数目,推断其倍数。首先计数总的染色体数目,然后根据
染色体的形态特征进行分组、配对。
2)将未知生物的染色体组型特征与已知生物的染色体组型特征进行比较,进而对未
知生物进行分类,归属于具体的门、纲、目、科、属、种、甚至亚种。
3)染色体组型分析可以用来鉴别染色体变异包括结构变异和倍数性变异。
三、用具与药品
剪刀、镊子、直尺、硬纸板、浆糊等
四、实验步骤
1、制作有丝分裂中期染色体玻片标本
采用植物根尖(如蚕豆、洋葱、大蒜、玉米等)去壁低渗法
培养材料——预处理——前低渗——固定——酶解去壁——后低渗——滴片——染色
2、选材与显微摄影
选材:细胞间无重叠,胞内染色体数目完整,每条染色体间无重叠,分散良好,染色体
粗细适中,都伸展开,处于同一平面上,并且染色鲜明、形态清晰、着丝粒明显,随体
可见。
选取上述的细胞进行显微照相。取清楚的底片放大成8cmx4cm左右的黑白照片。
万寿菊7对=14条
3、测量(首先对每条染色体随机标号)
测量每条染色体的长臂长度和短臂长度。以着丝粒为起点(若着丝粒过大将其一分为二)
分别量至长臂末端和短臂末端(以中间为准)单位为毫米,有随体的染色体,随体的长
度可以记入也可以不记入染色体长度之内,但应说明。另外染色体弯曲不能用直尺测量
的,可以先用细线量取与染色体等长的长度,再用尺子量出线的相应长度。
4、计算
绝对长度、相对长度、臂比、着丝粒指数总长度=1/n所有染色体长度之和(即染色
体组内全部染色体长度之和)。相对长度可降低误差,臂比表示两臂相对长度,比值越大,
说明二者长度相差越悬殊,进而推断着丝粒位置,长度相近着丝粒位于中央,悬殊时着丝粒
靠近短臂末端。
着丝粒指数:为整数如37表示37%,即短臂长度占染色体总长的37%,用短臂所占的
比例来描述着丝粒的位置。
5、配对
依据:同源染色体特征相似(形态、大小、着丝粒位置、随体有无)
1)从形态上初步推断2)在形态相似染色体的基础之上比较相对长度
3)着丝粒位置,依据臂比值或着丝粒指数判断4)有随体的根据随体的大小和位置判
断。
对照片上的染色体进行粗剪并进行配对。
6、排列
先画一直线,将染色体由大到小,短臂在上,长臂在下,着丝粒在直线上进行排列。等
长的染色体以短臂长的在前,带随体的染色体及性染色体排在最后。:.
7、分类:根据臂比值或着丝粒指数确定着丝粒位置,进而依照着丝粒的位置将染色体分
为四类。
1)中部着丝粒染色体(M):--50
————37
————25
4)端部着丝粒染色体(T):
8、剪贴并写出核型公式
如:K=2n=10=6m+2sm+2stsat
核型公式的意义:
作业:完成一种作物的染色体组型分析图
实验三、Hardy-Weinberg遗传平衡定律的验证(3学时)
一、实验目的
在调查本班同学某些遗传性状的基础上,学会计算控制各性状的基因频率和基因型频
率,掌握运用Hardy-Weinberg遗传平衡定律进行遗传性状分析的方法。
二、实验原理
群体:指一群同种个体所组成的集合。群体遗传学中的群体不是许多个体的简单集合,
而是一种特定的孟德尔群体,特指能进行随机交配的群体。在有性繁殖的生物中,一个物种
就是一个最大的孟德尔群体。
随机交配:指在有性生殖的生物中,一种性别的任何一个个体都有同样的机会和相反
性别的个体交配的方式称为随机交配。自花授粉植物形成的群体不是孟德尔群体,无性繁殖
的群体也不是孟德尔群体。
研究群体中的遗传结构,主要通过研究基因频率和基因型频率来表达,使之具有可分
析的形式,观察其在上下代之间的变化。
基因频率:指一个群体中某种基因的数量与群体中该基因的全部等位基因的比例。
基因型频率:指群体中某种基因型的数量与该群体中全部等位基因组成的基因型总数
之比。
遗传平衡定律:1908年英国数学家Hardy和德国物理学家Weinberg各自独立地运用数
学方法探讨基因在群体中的行为规律时得出一致的结论。内容:在一个充分大的Mendel群
体中,其个体间进行随机交配,假设没有自然选择的作用,没有新的突变发生,也没有个体
的大规模迁移,则群体中的基因频率和基因型频率为一个常数,可以一代代传下去,保持不
变。
人类一些相对性状是由一对等位基因控制的,按孟德尔方式遗传,假定某群体在某位
点上的基因A的频率为p、基因a的频率为q,如群体处于遗传平衡,则基因频率和基因型
频率保持如下关系:
[p(A)+q(a)]2=p2(AA)+2pq(Aa)+q2(aa)
现分两种情况介绍:
2、不完全显性时如人类对PTC尝味能力的差异表现不完全显性的遗传。也就是可
以观察到三种表现型,这样就能直接从三种表现型(基因型)的观察数算出表
现型频率,进而算出基因频率。现假定某人群为:
基因型AAAaaa
基因型观察数P’H’Q’P’+H’+Q’=N
三种基因型的频率为P(AA)=P’/NH(Aa)=H’/NQ(aa)=Q’/N:.
于是基因频率为p(A)=P+1/2Hq(a)=Q+1/2H或q=1-p
又假定该人群处于遗传平衡状态,根据已估出的p和q即可算出三种基因型的理论频
率及其相应人数。再与相应的实际观察人数比较,运用卡方检验,即能得出该人群是否处于
遗传平衡状态的结论。
2、完全显性时
另外一些性状,如卷舌与非卷舌,有耳垂与无耳垂,由于基因A对基因a为显性,所
以只能区别两种表现型,因而不能用表现型观察数直接算出基因频率。但我们可以假定该性
状处于遗传平衡状态,于是表现型【A】(包括AA和Aa)的频率为p2+2pq,另一表现型【a】
(基因型aa)的频率为q2,由此可用下式分别计算出p和q。
q=p=1-q
根据已算出的p和q值,推算出各基因型频率。最后算出显性表型中纯合体和杂合体
的比例。
三、实验用品
苯硫脲(PTC)溶液1-14号,或乙醇1-13号
,该溶液为1号,按等量对半稀释到14号为止。
取25%乙醇为13号,按等量对半稀释到1号为止。
四、实验步骤
1、PTC味盲基因测试
从14-1号逐个品尝,根据尝到苦味的阈值推测基因型。尝试阈值≥11号为纯合尝味者
TT,10-7号为杂合尝味者Tt,﹤7号为味盲型tt。
2、嗅阈测试
从1-13号逐个闻下去,直到有味为止,高度敏感型阈值为第1-6号,中度敏感型为7-11
号,不敏感型或嗅盲型为12-13号。
3、卷舌和耳垂的调查
能将舌的两侧卷起呈“U”型为卷舌者表型为[F],非卷舌者为[f];有耳垂指耳朵下缘与
头部连接处向上有凹陷者表型为[E],无耳垂为[e]。
五、作业
1、分别计算本班嗅觉基因的频率,检验分析该性状在本班是否处于遗传平衡状态。
2、计算卷舌和耳垂的基因型频率,并推算显性表型中纯合体和杂合体的比例。
实验四、果蝇的性状观察及饲养(3学时)
一、实验目的
1、了解果蝇生活史及各个阶段的形态特征
2、区别雌雄果蝇及常见突变型的主要特征
3、掌握果蝇的饲养管理技术
二、实验原理
黑腹果蝇为双翅目昆虫,个体发育为完全变态。用作实验材料有以下优点:1)容易饲
养,生活周期短,25度左右10天繁殖一代。2)繁殖能力较强,一只受精的雌蝇可产卵400-600
个,因此可在短期内获得较大的子代群体,有利于遗传学分析。3)突变类型多,有400个
以上,且多数为形态特征的变异,便于观察。4)唾腺染色体较大。因此,在遗传学研究中,
果蝇作为实验材料被广泛使用。
三、材料与用品
1、材料野生型及突变型果蝇
2、用具及药品:.
双筒解剖镜,放大镜,麻醉瓶、培养箱、白瓷板、毛笔、棉塞、载片、恒温培养箱、
吸水纸;***。
四、实验步骤
1、果蝇生活史的观察
1)卵:白色长椭圆型,左右,在其背面的前端具有两个
触丝。
2)幼虫:从卵中孵化出来后即为一龄幼虫,一龄幼虫蜕
皮后成为二龄幼虫,二龄蜕皮后成为三龄幼虫,三龄幼虫
较大,活动力强,常爬在培养基表面或培养瓶壁上。
3)蛹:幼虫经6-7天后即化蛹,附于瓶壁上,呈梭型,
初期柔软呈淡黄色,以后逐渐硬化变成深褐色,深褐色的
蛹就要羽化了。
4)成虫:刚羽化出来的果蝇,虫体较长,半透明乳白色,翅未完全展开。过12小时后,双
翅伸展开,体色加深,各种性状趋于明显。
5)影响果蝇生活史的因素:
I、营养条件:果蝇的食物是酵母菌,培养基发酵良好,酵母菌充足即可。
II、温度:适宜温度为10-25度,并随温度升高生活周期缩短,10度57天,15度18天,
20度15天,25度10天,低于10度、高于30度果蝇不育或死亡。
2、麻醉果蝇
1)制备麻醉瓶:用培养瓶或与培养瓶口径相同的玻璃瓶及橡胶塞棉花图钉组成
2)引出果蝇:将有果蝇的培养瓶用手轻拍,使果蝇震落瓶底,迅速拔出棉塞,将麻醉瓶与
培养瓶的两口相对,培养瓶在上,麻醉瓶在下,用手轻拍瓶壁或轻轻摇晃使果蝇落入麻醉瓶。
或培养瓶在下,麻醉瓶在上,并朝向灯光处,双手遮住培养瓶,利用果蝇的趋光性和向上性,
将果蝇引人麻醉瓶。
3)麻醉:在麻醉瓶瓶塞的棉花上滴1-2滴***,迅速塞入麻醉瓶瓶口,-1分钟左右大
部分果蝇即被麻醉落入瓶底,摇动麻醉瓶,全部果蝇震落瓶底,之后立即将果蝇倒在白瓷板
上,用毛笔小心拨动观察,若翅膀外展45度角表明果蝇已被麻醉致死。若中途有复苏的,
需在滤纸上滴加1滴***,并用培养皿盖住。
观察后要将果蝇放回原来的培养瓶,将培养瓶横放,然后用毛笔将果蝇扫入培养瓶中,待果
蝇苏醒后再将瓶竖起。
3、成虫雌雄性别的区别:
雌果蝇雄果蝇
体型大,末端尖,背部环纹5节,无黑小,末端钝,背部环纹3节,有黑斑
斑
腹部腹片7节腹片5节
第一对足跗节基部无性梳跗节基部有黑色鬃毛状性梳
4、果蝇常见突变型性状的观察
突变名称基因符号性状特征在染色体上座位
白眼W复眼白色
黑檀体E身体成乌木色,黑亮
残翅Vg翅明显退化,部分残留,不能
飞
焦刚毛sn刚毛卷曲如烧焦状:.
5、果蝇培养基的配制
水琼脂玉米粉蔗糖酵母粉丙酸
100ml1g10g10g
五、作业
写出果蝇性状观察中的注意事项及原种保存中应注意的事项。
实验五、果蝇杂交大实验(6学时)
一、实验目的
验证分离定律、自由组合定律、伴性遗传定律
二、实验原理
1、分离定律F2分离比3:1
2、自由组合定律F2分离比为9:3:3:1
3、伴性遗传正反交结果是否相同
例:培养灰身果蝇过程中出现黑身果蝇,请问1)黑身为显性、隐性?
2)该基因位于常染色体还是性染色体?3)由几一对等位基因控制?
4、卡方检验
三、实验步骤
1、设计杂交组合
2、挑选处女蝇
因为雌蝇体内有一贮精囊,一次交配后可保存大量精子供多次排卵受精用。刚孵化出的
果蝇一般8小时之内不进行交配,所以将雌雄分开,所得的雌蝇即为处女蝇。
3、F1幼虫出现时移去亲本果蝇
4、从F1中挑选3-5对转移到新的培养瓶中培养F2代
5、F2幼虫出现时移去F1成蝇
6、观察F2成蝇
7、统计分析
实验六、果蝇唾腺染色体的观察(3学时):.
一、实验目的
1、练****分离果蝇幼虫唾腺的技术
2、学****唾腺染色体制片方法
3、观察唾腺染色体结构的特点,了解其在遗传学中的意义。
二、实验原理:
双翅目昆虫如果蝇、摇蚊等的幼虫期都具有很大的唾腺细胞,其中的染色体就是巨大的
唾腺染色体。这些巨大的染色体具有许多重要特征,为遗传学研究的许多方面(如染色体结
构、化学组成、基因差别表达等)提供了独特的研究材料。
双翅目昆虫的整个消化道细胞发育到一定阶段之后就不再进行有丝分裂,而停止在分裂
间期。但随着幼虫整体器官以及这些细胞本身体积的增大,细胞核中的染色体,尤其是唾液
腺染色体仍不断地进行自我复制而不分开,经过许多次的复制形成约1000—4000拷贝的染
色体丝,合起来达5μm宽、400μm长,比普通中期分裂相染色体大得多(约100—150倍),
所以又称为多线染色体和巨大染色体。
唾腺染色体形成的最初,其同源染色体即处于紧密配对状态,称为体细胞联会、在以后
不断的复制中仍不分开,由此成千上万条核蛋白纤丝合在一起,紧密盘绕。所以配对的染色
体只呈现单倍数。黑腹果蝇的染色体数位2n=2×4,其中第II、第III染色体为中部着丝粒
染色体,第IV和第I(X染色体)染色体为端部着丝粒染色体。而唾腺染色体形成时,染色
体着丝粒和近着丝粒的异染色质区聚在一起形成一染色中心,所以在光学显微镜下可见从染
色中心处伸出6条配对的染色体臂,其中5条为长臂,1条为紧靠染色中心的很短的臂。
由于唾腺细胞在果蝇幼虫期一直处于细胞分裂的间期状态,每条核蛋白纤丝都处于伸展
状态,因而不同于一般有丝分裂中期高度螺旋化的染色体。唾腺染色体经染色后,呈现深浅
不同、疏密各异的横纹。这些横纹的数目、位置、宽窄及排列顺序都具有种的特异性。研究
认为,这些横纹与染色体的基因是有一定关系的。从其横纹分布特征可对物种的进化特征进
行比较分析,而一旦染色体上发生了缺失、重复、倒位、易位等,也可较容易地在唾腺染色
体上观察识别出来。可见唾腺染色体技术上遗传学研究中
一项基本的技术。唾腺染色体上的横纹宽窄、浓淡是一定
的,但在果蝇的特定发育时期会出现不连续的膨胀,称为
疏松区。目前人们认为这是这部分基因被激活的标志。
多线染色体的特征:1)染色体巨大,远远超过一般体
细胞染色体大小;2)唾腺细胞始终处于分裂的前中期状态,
且同源染色体配对在一起,故观察到的多线染色体数为n;
3)各条多线染色体上具有异染色质的着丝粒部分相互靠:.
拢,形成染色中心;4)由于DNA螺旋化程度不同,多线染色体上的横纹,表现深浅不同、
疏密相间,是基因所在的位置。
三、材料及用品
生理盐水(NaCl,KClCaCl2顺次溶于1000ml蒸馏水中)
解离液(20%HCl:45%醋酸=3:1或4:1或5:1),1%龙胆紫染液
四、实验步骤
1、幼虫的培养
18度,水分多的培养基,酵母菌充足
2、剖取唾腺
3、解离
在唾液腺上加解离液解离3分钟,用吸水纸将解离液吸去,并用蒸馏水冲洗2-3次。
4、染色
滴一滴甲苯***蓝染色液染色3-5分钟,之后用吸水纸吸去染液,并用蒸馏水冲洗多余的
染液。
5、压片加一滴蒸馏水放上盖片、覆以吸水纸用针柄轻敲几下,然后用拇指用力朝一个方
向揉片。
6、观察
光圈尽量调暗些
五、作业
绘出果蝇唾腺染色体图
实验七、观察不同诱变因素对染色体结构的影响(3学时)
一、实验目的
1、了解不同诱变因素对遗传物质的效应及诱变机制
2、学****诱发植物染色体结构变异的方法
3、认识畸变的几种类型
二、实验原理
常见畸变有染色体粘着、着丝点区域断裂、破坏纺锤丝形成、染色体或染色单体的断裂,
出现环状染色体及“染色体桥”和落后染色体异常等现象。
微核:是在理化因素作用下,细胞质内产生的一种小核。在不同的细胞中,这些小核的
数目不等。小核中如有核仁则具有合成DNA的能力。微核的来源可能来自染色体损伤后的一
些无着丝点断片;也可能是纺锤丝受损后,由各别落后的染色体形成。微核存在于细胞分裂
的各个时期,容易观察。:.
染色体畸变检测方法:1)在有丝分裂中、后期细胞中,统计染色单体断裂、无着丝点
断片和桥等的出现频率,这是一种比较客观、准确的遗传毒理学技术。2)微核检测法:由
于微核可以出现在细胞分裂的所有时期,因而观察时,不必考虑分裂相的多少,这种方法简
便、敏感。实践中往往将上述两种方法结合使用,效果可更为精确。
在遗传学研究、遗传疾病的诊断以及致突变致癌致畸变物质的检测方面应用较多。
三、材料及用品
R射线处理的种子,硫酸二乙脂处理的种子盐酸酒精解离液龙胆紫染液45%醋酸
四、实验步骤
1、根尖培养
2、固定
3、解离
根尖——解离10分钟——水洗——45%醋酸软化5分钟——水洗
4、染色及压片
染色5-8分钟
5、观察
五、作业
1、叙述诱变原理及检测方法
2、观察不同诱变统计细胞中畸变频率
3、绘出辐射处理后染色体发生畸变的有丝分裂制片图
实验八拟南芥的有性杂交
一、实验目的
二、实验原理
拟南芥(Arabidopsisthaliana)为十字花科拟南芥属。一年生细弱草本植物。株高
15至30厘米,随生长环境或培养条件变化。基生叶多数,长圆形或椭圆形,呈莲座状排列。
茎生叶具短柄或无柄。总状花序顶生,花瓣白色;雄蕊6枚(4强2短),花药黄色;雌蕊
圆柱状。长角果线形,长约10至16毫米,成熟时开裂。种子呈卵形,长约1毫米,成熟时
红褐色。
将种子用10%的漂白水(%次***酸钠)消毒20-30分钟,经无菌水冲洗3-4遍后,
在无菌条件下播种到MS培养基上,4℃春化2-4天后,在22℃,16h光照、相对湿度70%左
右的条件下培养,当幼苗具有4-6片真叶时,移入培养土中在温室中生长即可。由于个体小,
很容易在面积有限的温室或人工气候室内大批量地种植;而且,拟南芥对生长条件的要求并
不十分严格,这一特点使得在实验工作中很容易实现拟南芥的栽培管理。
在一般的栽培条件下,完成一个生长周期大约需8周左右的时间。还可人为控制条件(如
改变温度、延长光照时间)缩短生长周期。拟南芥的这一特性使实验工作周期大大缩短,特
别是对于许多遗传分析工作,比利用一般的高等植物材料(如麦类、豆类作物)可以成倍的
地节约时间。
既可以自交、又可人工杂交,在自然条件下,拟南芥是典型的自交繁殖植物,这使得拟
南芥在种植繁种过程中得以保持其遗传上的稳定性。同时在实验过程中,根据研究目的又可:.
方便地实施人工杂交,使得遗传分析工作很容易完成。
在培养条件良好的情况下,一个角果可结实数十粒种子;单株结实量可达数千粒甚至上
万粒之多!这使得很容易进行后代的遗传分析工作,也很容易扩增所需突变体的种子库,容
易被诱变产生所需突变体。
二倍体拟南芥有5对染色体,单倍体的基因组总长约为125Mb,已完成全基因组测序。
另外,在分子遗传学水平上,拟南芥具有基因组小、重复序列少、易于遗传转化等特点。
三、实验用品
处于开花期的拟南芥植株;尖头镊子;线绳等
四、实验步骤
选择刚刚露白的花蕾作为母本。这是杂交成功与否的关键所在。太幼嫩的花蕾去雄后雌
蕊会死亡,而发育稍过的花蕾其内部已在进行或完成自花授粉过程,因此难以达***工杂交
的目的。
用干净的尖端稍细的镊子由外向内依次剥去花萼、花瓣、雄蕊(共6枚,4长2短;此
时雄蕊的长度明显短于雌蕊,尚未进行自花授粉),只留下雌蕊。
注意不要触伤柱头,否则难以完成授粉作用。另外,雄蕊一定要去完全,如果留下一或
多根雄蕊,待第二天花柱伸长后依然可以进行自花授粉作用,使人工设计的杂交失败。
刚刚去雄的雌蕊柱头还未发育成熟,一般在去雄后第二天,柱头处于膨胀毛茸茸的状态
时,为最适合接受花粉的状态。
选择处于盛花期(四个花瓣完全展开呈十字状,花药为鲜黄色)的花朵作为父本,用镊
子夹住雄蕊柄部取下小花,在母本花的柱头上轻轻擦拭数次,做好标记。为保证授粉成功率,
可以连续两天进行授粉。
一般授粉在上午10点之前进行为宜;下午两三点钟花朵盛开较多时亦可。
两三天后,如果柱头明显发育长大,形成细长形的角果,则表明杂交成功。
为了验证杂交结果,一般F1植株还需取材进行鉴定(如相应抗性的筛选或者基因组PCR
等)
五、作业
论述拟南芥有性杂交的意义及杂交过程中的注意事项?
实验九根癌农杆菌介导的植物遗传转化
一、实验目的
。
。
二、实验原理
Ti质粒为根癌土壤杆菌菌株中存在的质粒(染色体外自主复制的环形双链DNA分子),
能够通过感染植物的伤口,将其上一段含有植物激素和冠瘿碱合成酶基因的DNA转移并整
合至植物受体的基因组中,天然的Ti质粒整合入植物基因组中的基因能够控制根瘤的形成
(Ti即tumor-inducing肿瘤诱发的缩写)。
Ti质粒中有2个独立的区域决定DNA转移及整合:T-DNA区(transferredDNA):.
和vir区(virlenceregion)。在Vir区基因产物的帮助下,T-DNA区能够插入植物基因组
中,并随植物基因组复制及遗传给后代。研究发现,T-DNA插入植物基因组时,其左右
两个边界区是必须的,而中间部分的序列可以去除或替换。利用此特点,可以将目的基
因插入该区域内。
基于Ti质粒这个结构特点,1983年Hoekema等提出双元载体策略:将去除致瘤基
因的T-DNA区从Ti质粒中分离,放置在一个能在农杆菌和大肠杆菌中复制的穿梭质粒
中。这个穿梭载体称为双元Ti载体。Vir区则存在于一个已经除去T-DNA的Ti质粒中,
在农杆菌中作为辅助质粒,通过反式激活使T-DNA能转移到植物细胞基因组中。通过
基因工程改造,将筛选标记基因、多克隆位点及能在植物中高表达的启动子和终止子等
按照一定的顺序放入T-DNA区中,即构成Ti衍生载体,作为单、双子叶植物转基因的
工程载体。
为了得到能够稳定遗传的转基因植物,一般用农杆菌转化的植物材料会选择愈伤组
织或者植物的生长点部位。前者可以通过分化和再生得到携带目的基因的转基因植株;
而利于转化的生长点部位主要包括根尖分生组织及花分生组织。浸花法转化拟南芥即是
用携带目的基因的农杆菌菌液浸泡拟南芥幼嫩花蕾中的分生组织,使得T-DNA区携带
目的基因插入到花分生组织细胞基因组DNA中,而花作为拟南芥的***官结实后产
生的种子中即携带目的基因,在繁殖过程中可以将外源基因稳定地遗传给后代。
利用此法转化拟南芥的转化率较高,常可以达到1%(即后代中阳性转化植株所占
比例)甚至更高。实际上,由于拟南芥的种子结实量大,即便转化率低一些,也还是很
容易从大量的后代中筛选获得转化植株。
三、实验用品
已抽薹但有许多未开花的幼嫩花蕾的拟南芥野生型(Clo0)哥伦比亚型植株;经带有目
的基因的Ti质粒转化的根癌农杆菌;抗性MS培养基等。
四、实验步骤
选择合适的限制性内切酶组合,将目的基因按照正确的方向插入Ti质粒的多
克隆位点中。构建好的重组质粒通过化学转化或电转化的方法转入根癌农杆菌感受
态细胞中,从而得到含有携带目的基因Ti质粒的农杆菌菌株。
%次***酸钠消毒10-20分钟、用无菌水清洗3-4次后将消毒
后的种子在4℃下春化2至3天,直接播种于营养土与蛭石的混合物(营养土与蛭
石的体积比为1:1或2:1),培养室温度控制在22℃(昼)/18℃(夜),光周期为
12h,光强为80-120mol/m2/s。培养幼苗至2对真叶后间苗,在直径为10cm的花盆
中每盆保留4-5株。待植株抽薹至3-5厘米左右高时剪去茎的尖端使次生花序生长,
剪切位点应在最顶端茎生叶的上方(使腋生花序的茎位于茎生叶的基部)。继续培
养大约4-5天后的植株可用于转化,此时的植株已有侧枝发生、并已有一些花蕾。
将前述用含目的基因的Ti质粒转化的农杆菌接种于含有相应抗生素的YEB或
LB培养基中,28℃,200r震荡培养至菌液混浊,转化前一天接种于含相同抗生素的
-,离心收集菌体,重新悬浮于转化
拟南芥的渗入缓冲液(1/2MS盐、5%蔗糖溶液,现用现配),调节农杆菌密度使OD600
。
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