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常规病毒学实验技术.docx

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常规病毒学实验技术.docx

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常规病毒学实验技术.docx

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(一)病毒的培养
实验动物:家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠主要用于:
①分别病毒,并借助感染范围试验判断病毒
②培养病毒,制造抗原和疫苗
③测定各毒株之间的抗原关系,(用实验动物作中和试验和交织保护实验)
④制备免疫血清和单克隆抗体
⑤作病毒感染的实验研究,包括病毒毒力测定、建立病毒病动物模型等
注意:选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系,以及合适的接种路子和剂量。
鸡胚
(一)条件要求
SPF鸡、孵化温度38-39℃,湿度40-70%,通风。新鲜受精卵:产下后不高出10天并保存10℃左右。
(二)优点
组织分化程度低,可选择不同样的日龄和接种路子,病毒易于增殖,感生病毒的组织和液体中含有大量病毒,简单收集和办理,而且本源充分,设备和操作简略易行。
(三)接种路子
(10-12日龄鸡胚)
主要用于痘病毒和疱疹病毒的分别和增殖。
1)方法一(造人工气室)
①在胚胎周边近气室处,选择血管较少的部位,用电烙器在卵壳上烙一个直径约
3-4mm的烤焦圈。
②用碘酊和酒精消毒后,小心用刀尖撬起卵壳,造成卵窗。
③在气室端中央钻一个小孔。
④用针尖挑破卵窗中心的壳膜,切勿伤害其下的绒毛尿囊膜。
⑤滴加滴生理盐水于刺***,用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气,造成气室内负压,使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形***工气室,此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速浸透。
⑥用1ml注射器滴入2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。
⑦用透明胶纸封住卵窗,或用玻璃纸盖于卵窗中,周围涂上消融的白腊密封,气
室中央的小孔用白腊密封。
⑧鸡胚横卧于卵箱中,禁止翻动,保持卵窗向上。
2)方法二
①×。
②用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜。
③滴入接种物。
④用透明胶纸封闭张口。
(10-11日龄)
用于正粘病毒和副粘病毒(NDV)
1)画出气室和胚位
2)在气室凑近胚位处涂沫碘酊和酒精消毒
3)用钢锥穿一小孔
4)-1cm,注入接种物
5)用白腊封口,置孵卵箱中孵育,每天翻卵1-2次
(6-8日龄)
主要用虫媒病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分别和增殖。
1)画出气室和胚位
2)垂直放置在卵座上,用碘酊和酒精消毒气室外端
3)以钢锥在气室中央锥一小孔
4)将注射器针头沿此小孔插入3cm,注入接种物
5)用白腊封口,置孵卵箱中孵育,每天翻卵1-2次

羊膜腔接种,正粘病毒和副粘病毒
静脉接种,蓝舌病毒
脑内接种,狂犬病毒
组织培养
原代细胞:应用胰酶均分别剂将动物组织消化成单个细胞悬液,合适冲洗今后,
加入营养液,平时即可使其贴附于玻璃壁上,并生长增殖。
继代细胞:将原代细胞从玻璃瓶壁上消化下来再作培养。
传代细胞:由于遗传突变也许在理化学物质和致瘤病毒的作用下,组织培养细胞中有时出现恶性变细胞,也就是癌变细胞,这种病变细胞拥有很高的增殖势能,而且几乎可以无量地传代。
原代细胞培养(以鸡胚成纤维细胞为例)
1)在无菌条件下采用9-10日龄鸡胚,置灭菌平皿中,除掉头(或仅除掉喙和眼)、
爪和内脏,并剪成块。
2)用Hanks液,充分冲洗后移入大号青霉素瓶或其他广口瓶中,用眼科剪剪成
3
1mm大小的碎块。
3)加入Hanks液,充分冲洗,并静置几分钟,待组织块下沉,吸弃上层液体,再
加洗液。这样屡次冲洗2-3遍。
4)%胰酶,-,振荡混匀
后置37℃水浴中感作30分钟,每10分钟轻轻摇动一次。
5)取出,小心吸弃上层胰酶溶液,用洗液轻洗2次后,用大口径吸管屡次吹打,
使细胞游离。
6)用双层或三层纱布过滤,收集滤液于离心管中,以600rpm离心积淀5-10min,
吸弃上清液,按每个鸡胚5ml的量,加入营养液,并用吸管屡次吹打,直至形
成均匀的细胞悬液。
5
+%结晶紫——构椽酸()溶液,室温或37℃
温箱中5-10分钟,充分振荡后进行计数。
按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数(N)。每ml悬液中的细胞数(n)=N/4×10000×K(稀释倍数)。
传代细胞系培养
优点:1)可以无量的传代。
很多细胞系对病毒很敏感。
某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养,合适病毒抗原的大量生产。
生长旺盛,生殖迅速,对营养条件不苛刻。缺点:在传代过程中碰到支原体和病毒的污染。
细胞分别剂
,
以致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分其他单个细胞。***四乙酸二钠(EDTA)
营养液

氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。

1)动物血清中含有细胞生长所必定的各种营养因子。
2)促进细胞的贴壁和生长。
3)拥有很强的酸碱缓冲作用。
(二)病毒感染力的滴定
LD50,EID50,TCID50
TCID50的测定)

10倍的稀释,从10-1—10-10。

96孔微量培养板中,每一稀释度作
8孔,每孔接种
100ul。

100ul,使细胞量达到
3×105个/ml。
,正常细胞比较作两纵排。
,一般需要观察5-7天。
,按
Reed-Muench两氏法或Karber法进行。
TCID50的计算方法:
-Muench法
病毒液
出现
不出现
累计
出CPE的
CPE
不出现
孔所占
稀释度
CPE孔

出现CPE孔
CPE孔
的%
10-1
8
0
27
0
100
(27/27)
10-2
8
0
19
0
100
(19/19)
10-3
7
1
11
1
(11/1
3
5
2)
10-4
1
7
4
6
40(4/10)
10-5
1
13
(1/13)
10-6
0
8
0
21
0(0/21)
高于50%的百分数-50%
-50
距离比率=
=
=
高于50%的百分数-低于50%的百分数
-40
lgTCID50=距离此例X稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数
=×(-1)+(-3)=-
-
50
TCID=10

病毒液稀释度
出现CPE孔的比率
10-1
8/8=1
10-2
8/8=1
10-3
7/8=
10-4
3/8=
10-5
1/8=
10-6
0/8=0
lgTCID50=L-d(s-)
最高稀释度的对数D:稀释度对数之间的差S:阳性孔比率总和
lgTCID50=-1-(-1)×(-)
=-
-
TCID50=10/
(三)病毒中和试验
一、原理
抗体与相应的病毒粒子特异性地结合,使后者丧失感染能力。
二、用途

病毒分别株的判断。
不同样病毒株的抗原关系研究。
疫苗免疫原性的议论。
免疫血清的质量议论。
测定实验动物血清中可否存在抗体等。
三、分类
(一)终点法中和试验
固定病毒——稀释血清法。
1)将测好TCID50的病毒稀释成200个TCID50的病毒悬液。
2)在96孔微量培养板中将血清作连续倍比稀释(详尽方法是在96孔板中先加
入50ul生长液,再加50ul待检血清,混匀后,吸50ul至下一孔,这样下去。向到达1:256),每个稀释度作4孔。
在上述各孔内加入50ul稀释好的病毒液,混匀后放入37℃5%CO2培养箱中作
用45min-60min。
同时设待检血清毒性比较,阴、阳性血清比较,病毒比较和正常细胞比较。
感作达成后每孔加入100ul细胞悬液,放37℃5%CO2培养箱培养,每天观察并记录结果。
结果计算,按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。
Reed-Muench计算方法:
CPE孔
无CPE孔


血清稀释度
CPE孔数
无CPE孔数



护率(%)
1:4(10-
)
0
4
0
9
100
1:16(10-)
1
3
1
5
83
1:64(10-)
2
2
3
2
40
1:256(10-)
4
0
7
0
0
1:1024
4
0
11
0
0
(10-)
距离比率=
高于50%的保护率-50%
高于50%的保护率—低于50%的保护率
83-50
=
=
83-40
高于50%的保护率血清稀释度的对数
+距离比率×稀释系数的对数
=-+×(-)
=-
-=1/46
即:1:46稀释的待检血清可保护50%的组织培养细胞免于出现CPE。
2.
固定血清——稀释病毒法。
1)
将病毒作连续10倍稀释
1)将稀释好的病毒接种96孔板,每个稀释度接种一纵排共
8孔,每孔50μl,
做两块板子,在一块板子的每孔加入
50μl待检血清(试验组),另一块板子的
每孔加入50μl正常血清(比较组),混杂后置37℃5%CO2培养箱作用1h。
2)尔后在每孔中加入100μl细胞。
3)别的还设两纵排正常细胞比较。
4)置37℃5%CO2培养箱培养,每天观察并记录结果。
5)分别计算每组病毒的TCID50,尔后计算血清的中和指数。
试验组TCID50
中和指数=
比较组TCID50
(二)蚀斑(痘斑)减数试验
1、蚀斑技术
病毒蚀斑:又称空斑,指病毒在已长成的单层细胞上形成的限制性病灶。
原理:将病毒悬液作连续的10倍稀释,随后各取定量,接种于已经长成单层的敏感细胞上,并覆盖中性红琼脂糖,待其出现蚀斑后计数,即可算出每毫升病毒悬液中所含的蚀斑单位。
用途:①用于病毒纯化;②测定病毒悬液中感生病毒的含量。
2、蚀斑减数试验
将病毒——正常血清混杂物以及病毒——待检血清混杂物分别接种到单层细胞上,随后覆盖营养琼脂或***纤维素,进行蚀斑测定,比较病毒——正常血清组和病毒——待检血清组产生的蚀斑数,两者的差数表示待检血清的中和能
力。以试验组的蚀斑数比比较组减少50%作为判断依照,血清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。
(三)交织保护试验
先将实验动物进行主动免疫或被动免疫,尔后以待检病毒进行攻击,依照实
验动物被保护的情况,判断待检V的种类或型别。其缺点是试验周期太长,而且
需要大量的实验动物。
用途:(1)应用已知V判断未知V
(2)应用已知免疫血清判断未知V
(3)应用已知V判断未知血清
(四)病毒的分别和判断
病毒资料的注备
、肝、肌肉等器官或组织
充分研磨后加入5倍量的Hank’s液()屡次冻融三次。
2000rpm10min,取上清作接种物。
、乳汁、脓汁均分泌物或溢出物
用内含青、链霉素100u/ml的Hank’s液,将其稀释3-5倍,充分混匀悬浮后,置4℃冰箱内感作2-4h或过夜,200rpm10min取上清作接种物。

仔细用棉拭子擦拭咽喉部,并迅速将其泡入盛有

2-5mlHank’s液的
200-500u/)试管内,充分涮洗棉拭子,屡次冻融3-5次,收集液体部分,
2000rpm10min,收集上清作接种物。

用含100u/’s液作10-20倍稀释,4℃感作4h,2000rpm10min
取上清作接种物。

直接接种用。
接种方法


目前常用鸡胚分其他病毒有正粘

V、副粘

V、痘

V、脑炎

V及引起禽类疫病的其
它好多V。

病毒增殖的判断
(CPE)



乙型脑炎V
流感V
猪传染胃肠炎



脊髓灰质炎V
西方马脑炎V
牛病毒性膜炎

粘膜病

V
病毒感染力的滴定
LD50、EID50、TCID50
病毒理化学特点的测定
(药物控制试验)
FUDR、IVDR、BRUDR
原理:FUDR、ICDR、BRUDR是嘧啶的卤化物,进入cell后发生磷酸化,掺入新合
成的DNA以代替胸腺嘧啶产生至功能分子,从而控制DNA的合成。常用浓度
为50ug/ml。)***敏感试验
取同批病毒分装于两个青霉素瓶中,每瓶16ml,在其中1瓶加入麻醉用***,使终浓度为20%,两瓶均用橡皮塞塞紧后,置4℃冻箱内作用24h,此间不时振荡,随后以2000rpm离心20min。已加***的小瓶,用毛细吸管吸取病毒液,移入另一
小瓶内,合适吹打,使节余***挥发殆尽,尔后滴定两组病毒的TCID50。
2)***仿敏感性试验
向病毒液内加入解析纯***仿,%,置4℃振荡混杂10min。随
后500rpm5min,尔后吸取上层液体,滴定病毒TCID50。比较组病毒加入终浓度为
%的生理盐水,同样办理和滴定。

脊髓灰质炎V、猪传染性胃肠炎V对胰酶有较强的抵抗力,痘V、呼肠孤V、
疱疹V易被胰酶灭活。取病毒液两瓶,每瓶1ml,在其中1瓶加入1ml1%的trypsin,
%,另一瓶加入1ml1640(培养基),用橡皮塞塞紧瓶口,将小瓶
倒转几次,使其充分混杂,置37℃1h,随即加入灭活犊牛血清8ml,充分混杂,
50
停止胰酶的作用。最后滴定两瓶V的TCID。


取等量病毒液两瓶,(or
),并在另一个小瓶内加入同样于用酸量的培养基作为比较,置37℃水溶或室
温中感作2h(or1h),%,比较组再加紧
入同样于NaHCO3量的培养基,测定两者的TCID50。

将病毒液分成等量的11小瓶,其中4小瓶分别置50℃、60℃、70℃、80℃水
溶中1h,另6瓶置50℃水浴中分别感作5、10、15、30、60和180min,随后测定
每瓶V的感染X。

电子显微镜直接观察(透射电镜、磷钨酸负染)
超速离心积淀
滤过试验
取澄清的病毒液20ml,留出1ml作为比较,将节余的19ml病毒液在正压下依次经过孔经为450nm、225nm、100nm和50nm的各级微孔,每经过一种孔径的滤膜就吸取1ml滤液用为样品,并将节余的滤液经过一次滤膜。最后测定原病毒液以
及各级滤液的TCID50。
病毒液种类
TCID50/
滤前病毒液
10
-
450nm孔径液
10
-
-
225nm孔径液
10
-
100nm孔径液
10
-
50nm孔径液
10
免疫——血清学检查
目的:①新分别毒株的种类及型其他判断。
②检测发病动物体液中的Ab,或进一步比较动物急性发病期和恢复期血清中的Ab效价,认识病毒性Ab可否有明显的增加,从而判断V感染的存在。
(一)中和试验

固定病毒——稀释血清法中和试验
固定血清——稀释病毒法中和试验
(痘斑)减数试验
1)蚀斑技术
病毒蚀斑,又称空斑,指病毒在已长成的单层细胞上形成的限制性病灶。
原理:将病毒悬液作连续的10倍稀释,随后各取定量,接种于已经长成单层的敏感细胞上,并覆盖中性红琼脂糖,待其出现蚀斑后计数,即可算出病毒悬液中每毫升所含的蚀斑单位。
用途:①用于病毒纯化;②测定病毒悬液中感生病毒的含量。
2)蚀斑减数试验
将病毒——正常血清混杂物以及病毒——待检血清混杂物分别接种到单层细
胞上,随后覆盖营养琼脂或***纤维素,进行蚀斑测定,比较病毒——正常血清组和病毒——待检血清组产生的蚀斑数,两者的差数表示待检血清的中和能力。
以试验组的蚀斑数比比较组减少50%作为判断依照,血清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。

先将实验动物进行主动免疫或被动免疫,尔后以待检病毒进行攻击,依照实
验动物被保护的情况,判断待检V的种类或型别。其缺点是试验周期太长,而且
需要大量的实验动物。
用途:(1)应用已知V判断未知V;
(2)应用已知免疫血清判断未知V;
(3)应用已知V判断未知血清。
(五)凝集试验
定义:
颗粒性抗原(如细菌、红细胞等)或表面载有抗原的颗粒状的物质(如聚苯
乙烯胶乳、红细胞、炭素颗粒等),与相应抗体在电解质存在下凝集成团的试验。
分类
直接凝集试验:颗粒状Ag与相应Ab所发生的凝集反应。(布氏杆菌)
间接凝集试验(被动凝集试验):可溶性抗原吸附到载体颗粒表面,与相应抗体所发生的凝集反应,可以证明相应抗体的存在并测定效价。反相问接凝集试验
(反向被动凝集试验):将抗体吸附到颗粒表面与相应抗原所发生的凝集反应。间接血凝试验
胶乳凝集试验
炭凝集试验间接凝集试验
皂土凝集试验
脂质体凝集试验
间接凝集控制试验:先将被检的抗体(或抗原)与已知的抗原(或抗体)作
用后,再与抗体(或抗原)致敏的颗粒时行反应。
反向凝集控制试验
间接凝集试验的优点:迅速、简略、特异、敏感间接血凝试验(IHA)(PHA)
口蹄疫、猪瘟、弓形体、胸膜肺炎、衣原体
反向IHA:FMDV、水疱病病毒Ag、猪传染笥胃肠炎病毒Ag、小鹅瘟病毒Ag
等。
红细胞作为载体的优点:
,简单获取。
,如蛋白质、糖蛋白、核蛋白以及多糖等。
,比其他好多载体都更简单标准化和规格化。
缺点:简单破裂、难于保存
IHA的优点:
①敏感性高、特异性强、重复性和牢固性好,操作简略、反应迅速。
②既可定性又可半定量,而且试剂价格廉价,不需要特别、复杂的设备。
注意:影响红细胞凝集的因素好多:红细胞的本源,致敏条件、操作技术、标本中的杂质、细菌污染和类属Ag常引起非特异性凝集反应。

选择:好多种类动物的红细胞,包括人的
羊红细胞。

0型红细胞都可用,但用得最多的是绵
保存:用玻璃珠脱纤法收集或用肝素抗凝。
②无菌的红细胞在4℃冰箱中可保存3-4天。
②采血时加等量氏液和合适抗生素,4℃保存2周,但这样红细胞致敏时容液自凝。

醛化剂:甲醛、戊二醛、***醛、***醛—甲醛双固定、戊二醛—***醛双固定。
1)无菌采用绵羊静脉血,加至红细胞保存液内,4℃保存备用。
2)取红细胞悬液1份,、(),洗5遍,并以该液配成8%红细腻悬液。
3)红细胞悬液1份+3%***醛液等量,24左右的室温中用电磁搅拌器缓慢搅拌
17h。%悬液,——***醛固定红细胞悬液。
4)***醛固定红细胞悬液1份+等量3%甲醛液,如上搅拌17hr。
5),%%的红细胞
悬液,分装后置4℃冰箱内保存,可用2个月—双醛化红细胞悬液。

作用:可增加红细胞吸附蛋白质的能力,新鲜红细胞用1:200000浓度的鞣酸,
醛化红细胞用1:100000浓度的鞣酸。
程序:取红细胞,—5遍,%悬液,:200000优秀鞣酸,将其与红细胞悬液等量混杂,37℃水浴咸作15min。,%红细胞悬液。
:
1)抗体致敏红细胞
取20%鞣化或未鞣化的双醛化红细胞悬液1ml,离心积淀,弃去上清液,将沉
淀红细胞重新悬浮于醋酸缓冲液10ml中,加入等量的提纯IgG液(每毫升需含
IgG100~300g)置37℃水浴中咸作2-4h,每15-20分钏用吸管轻轻吹吸混杂2-3
次。,再将积淀红细胞用1%%悬液备用。
——Ab致敏红细胞悬液。
2)抗原致敏红细胞
取PBS()4ml病毒抗原1ml,%鞣酸化红细胞悬液1ml,混匀后,置室温下振荡结合30—60min(随病毒Ag种类不同样)或37℃水浴30-45min,此间适
当振摇。随后以1500rpm离心积淀10min,(内含1%灭活兔血清)洗2遍后,配成1%的致敏红细胞悬液供试验用。以病毒致敏的红细胞悬液应马上使用。4℃冰箱保存,不宜高出2天。
※致敏红细胞的保存:用1%%明胶缓冲液冲洗,%悬液保存备用。长远保存:用含1%糖和4%兔血清的生理盐水,将致敏红细胞配成10%悬液,尔后于真空中冷冻干燥。