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WB注意事项及常有问题
注意事项
一、样本采集
组织样本
原则上要求客户或我们的技术员把组织分切剪碎至研磨管(依据实验的需要告
知他们取多少组织),并加入适当裂解液和研磨珠,而后搁置于-80℃保留。详细
详情参照“”;
细胞样品
原则上要求客户或我们的技术员不要用胰酶把细胞消化下来,特别是分选对象是
膜蛋白时,详细详情参照“”;
二、总蛋白提取
组织样品
详细详情参照“”;记得加入蛋白酶克制剂,假如分选
对象是磷酸化蛋白时,记得加入磷酸化酶克制剂;
细胞样品
详细详情参照“”;记得加入蛋白酶克制剂,假如分选
对象是磷酸化蛋白时,记得加入磷酸化酶克制剂;
三、蛋白样本保留
裂解细胞或组织提取总蛋白时,细胞碎片积淀一般-20℃保留以防万一,提取
好的蛋白样品分装2份,一份加入上样缓冲液变性后-20℃保留,一份直接-20℃
保留;
四、蛋白变性
提取好的总蛋白取一部分(不是所有)加入上样缓冲液进行加热变性(100℃,
5min),变性好的蛋白应该-20℃保留,冻融后不再需要加热变性;
五、SDS-PAGE
%,用于压沉样品;
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分别胶的胶浓度取决于分析对象的分子量大小,;
分别胶和浓缩胶的高度比为8:3;
电泳结束后,应及时用冲洗洁净玻璃板,冲洗时应使用海绵擦布,切勿使用刷子,免得刮花玻璃板;
电泳结束后,应及时冲洗电泳槽,免得盐离子堆积,以致电泳丝腐化;
冲洗电泳芯时,必定要注意别弄段电泳丝;
六、转膜
注意海绵垫,滤纸(转膜专用滤纸),转印膜,胶的叠放地址,以保证正确的转印方向;
注意海绵垫,滤纸(转膜专用滤纸),转印膜,胶的相对大小,免得造成短路;
,应及时拿出转印膜,并马上用TBST漂洗1-2遍,并马上加入
关闭液,这样能够防范膜上的杂质残留或膜变干以致背景高的问题;
转印结束后,应及时冲洗转印槽和转印芯,免得盐离子堆积,以致电泳丝腐化;
转印结束后,应及时用水泡洗海绵垫和滤纸,免得盐离子堆积,以致转膜时短路,并放在篮子上晾干,假如海绵垫和滤纸不及时晾干,简单以致海绵垫和滤纸内部的构造损坏;
七、关闭
进行关闭时,应加入足量的关闭液(以完整覆盖膜为底限),并保证整个关闭
过程中,膜与关闭液充分接触,防范长时间分开关闭液,特别进行4℃静止关闭留宿时,必定要加入足量的关闭液和保证平坦搁置;上述注意事项主要为了防范膜变干,以致背景高升;
八、一抗杂交
一抗的稀释比率:第一次使用时参照详细抗体说明书建议的稀释比率,并依据实质的实验结果进行调整;
杂交条件:假如是室温孵育,最少保证孵育1-2小时,并搁置脱色摇床长进行摇摆,假如是4℃孵育,应孵育留宿,可静止亦可搁置脱色摇床长进行摇
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,使用后进行回收并4℃保留,假如回收
的稀释抗体用积淀或长菌,应扔掉;
九、一抗杂交后洗膜
一般使用标准的TBST缓冲液,假如判断因为是一抗的原由以致的背景过高,能够把NaCl的浓度提升到500nM(标准的为150nM);
一般清洗3次,每次10min,假如判断因为是一抗的原由以致的背景过高,能够把清洗次数提升到4-6次;
十、二抗杂交
二抗的稀释比率:第一次使用时参照详细抗体说明书建议的稀释比率,并依据实质的实验结果进行调整;
杂交条件:一般室温孵育,孵育1小时即可(时间延伸会产生非特异杂交,从而以致背景过高),并搁置脱色摇床长进行摇摆(必定要防范膜变干,不然背景其高);
应使用关闭液进行稀释,使用后进行不回收;
十一、二抗杂交后洗膜
一般使用标准的TBST缓冲液,假如判断因为是一抗的原由以致的背景过高,能够把NaCl的浓度提升到500nM(标准的为150nM);
一般清洗3次,每次10min,假如判断因为是一抗的原由以致的背景过高,能够把清洗次数提升到4-6次;
十二、摄影
注意选择曝光时间,同时兼备工作效率,因选择连续摄影模式,这样总有一个何时曝光时间;
十三、报告单整理
原始图片;
比较度和亮度调整的图片;
图片说明:上样次序;
灰度值:原始值,数据标准化(同一个样品的目标蛋白的灰度值除之内参蛋
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白的灰度值),相对表达量(实验样品的数据标准化比值除以参仍旧品(问客
户)的数据标准化比值),参仍旧品的相对表达量必定为1;
实验方法:正确的一抗,二抗,稀释比率;
常有问题
一、没信号
膜一片空白,没有任何条带,阳性比较样品也无条带:实验失败?抗体无效?;从头进行实验,从头稀释抗体;
膜一片空白,没有任何条带,阳性比较样品有条带:实验样品降解?实验样品无该蛋白的表达?转膜效率过低?;从头进行实验,复核查找上述原由,以找寻对策;
二、背景过高
目的条带之外的地区有信号,假如是片状,甚至整块膜,一般是关闭不好,膜变干,一抗非特异杂交或二抗的非特异杂交以致;假如是条纹状,一般是因为膜上有压痕以致,假如是点状,一般是膜上有杂质,或泡膜时膜没有充分浸泡;
三、杂带
目的带之外的信号条带为杂带,一般因为一抗的特异性不好所以致,假如目的带比杂带信号强,可经过减低一抗的稀释比率,并缩短杂交时间解决;如
果目的带比杂带信号弱,在不减低一抗的稀释比率的前提下,缩短杂交时间;并提升TBST缓冲液的NaCl的浓度提升到500nM;
杂带假如与目的带的地址相距较远,能够不优化实验,直接裁剪即可,杂带假如与目的带的地址相距较进,应调整胶浓度,并延伸电泳时间,已经采纳上述解决方法;
四、目的带弱
一抗效价低:提升一抗稀释比率,提升杂交时间,减少洗膜次数,提升曝光时间,提升上样量;
转膜效率低:检测转膜试剂和耗材,优化转膜条件;
五、复合问题
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上述问题常常同时出现,第一客观沉着分析问题所在,针对问题采纳相应策略,
有些策略可能相互矛盾,应以解决主要问题为主;
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