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甘肃中医药大学
第一页,共二十四页。
精选课件
MTT法目的(mùdì)和意义
检测细胞存活和生长情况(qíngkuàng)
用于评价药物产生的细胞毒作用
第二页,共二十四页。
精选课件
原理(yuánlǐ)
四唑盐(噻唑蓝)是一种能接受氢原子的染料,简称MTT
活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原(huányuán)为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二***亚砜(DMSO)能溶解细胞中的紫蓝色结晶物,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量,从而反映细胞的增殖情况。
在一定细胞数范围内,MTT结晶物形成的量与活细胞数成正比。
第三页,共二十四页。
精选课件
活细胞(xìbāo)+MTT
琥珀酸脱
氢酶
紫蓝色结晶(jiéjīng)物Formazan
第四页,共二十四页。
精选课件
贴壁细胞操作步骤
1.  接种细胞:%胰蛋白酶消化(xiāohuà)单层培养细胞,用含血清的培养液配成单个细胞悬液,以每孔2000-3000个细胞接种于96孔培养板中,每孔体积90ul。(边缘孔用PBS或空白培养基填充)。 2.  培养细胞:将培养板移入CO2孵箱中,在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板,大约12h),加入浓度梯度的药物。原则上,细胞贴壁后即可加药,每孔加药10ul,一般设5个复孔。
%CO2,37℃孵育分别孵育24小时后,倒置显微镜下观察。
第五页,共二十四页。
精选课件
(5mg/ml,%MTT),继续培养4h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液。
,小心吸去孔内培养液。
***亚砜(置摇床上低速(dīsù)振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
(培养基、MTT、二***亚砜),对照孔(细胞、培养液、MTT、二***亚砜)
第六页,共二十四页。
精选课件
悬浮(xuánfú)细胞操作步骤:
1)将细胞离心收集后,调节细胞悬液浓度大约1×104/ml,每孔先加细胞悬液90ul,相应梯度的药物每孔10ul;共100ul加入到96孔板(边缘孔用PBS填充)。每板设对照。同时设置调零孔(培养基、MTT、二***亚砜),对照孔(细胞、培养液、MTT、二***亚砜),每组设5个复孔。
2)置37℃,5%CO2孵育24小时,倒置显微镜下观察。
3)每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml,%MTT),继续(jìxù)培养4h
4)每孔加三联裂解液(10gSDS,异丁醇5ml,)过夜,第二天早晨置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm测量各孔的吸光值。
第七页,共二十四页。
精选课件
药物(yàowù)的配制
浓度
体积(tǐjī)
过滤
第八页,共二十四页。
精选课件
MTT的配制(pèizhì)
MTT一般最好现用现配,过滤后4ºC避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是(huòshì)黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT有致癌性,用的时候小心,,MTT对菌很敏感;往96孔板加时不避光也没有关系,因为时间较短。
第九页,共二十四页。
精选课件
实验(shíyàn)结果统计学处理
所有数值以x±s表示,应用(yìngyòng)SPSS软件进行方差分析,p<,p<。可以以时间为横轴,光吸收值为纵轴绘制细胞生线曲线,专门公式求IC50(半数抑制浓度)。或计算抑制率。
OD对照组-OD实验组
抑制率%=
OD对照组
×100%
第十页,共二十四页。
精选课件