文档介绍：质粒提取、纯化、电泳检测
质粒DNA的提取、纯化和电泳检测
【实验目的】
1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用;
2、掌握碱变性法提取质粒DNA的方法;
3、学****并掌握凝胶电泳进行DNA分离纯化的实验原理;
4、学****并掌握凝胶的制备方法;
5、学****并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法;
6、 DH5α(pUC19)在含有氨苄培养基上的生长情况并了解其原理。
【实验原理】
1、携带外源基因并将外源基因导入宿主细胞,使之进行扩增和表达的媒介称为载体。在基因工程操作中载体具有以下性质:;(多克隆位点);;。
2、质粒 DNA 是原核生物除类核中的染色体 DNA以外,细胞质中含有的一个或多个能独立复制并稳定遗传的小环状双链 DNA 分子。除酵母的杀伤质粒为 RNA 外, 迄今发现的所有质粒均为双链环状DNA 。多数质粒只有几千个 bp 但也有一些质粒达105bp 以上,一般分子量在( 4~100) × 106道尔顿范围内。不同的质粒在细胞内的拷贝数不同。细胞内含有1-3个拷贝的质粒为低拷贝质粒(严紧型复制),当质粒数在10
个拷贝以上,为高拷贝质粒(松弛型复制),用于载体构建质粒多为松弛型。
3、,含有以下构件:;氨苄青霉素抗性基因(Ampr);-半乳糖苷酶基因(LacZ)的启动子及编码β-半乳糖苷酶的DNA序列;多克隆位点(MCS)区段。
4、质粒在细胞内以共价闭合环状DNA的形式存在,cDNA)。在抽提质粒DNA的过程中,由于各种因素影响,使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA的一条链断裂,变成开环DNA(ocDNA),若两条链发生断裂则转变为线状DNA(L DNA)。一般情况下,超螺旋型迁移速度最快,其次为线状分子,最慢的是开环状分子。
5、在细菌细胞中,染色体DNA以双螺旋结构存在,质粒DNA以共价闭合环状形式存在,细胞破碎后,染色体DNA和质粒DNA均被释放出来,但两者变性和复性所依赖的溶液pH值不同。,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性,共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂,但两条互补链不完全分离。,变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中;但染色体DNA不能复性,而是与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心与复性于溶液的质粒DNA分离。
6、溶于上清液的质粒DNA,可用无水乙醇和盐溶液,使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似,乙醇沉淀DNA的同时,也伴随着RNA沉淀,可利用RNase A 将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白,可通过酚/***仿抽提出去,最后获得纯度较高的质粒DNA。
7、凝胶是支持电泳介质,具有分子筛效应。琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径,一定大小的DN***段在不同浓度的琼脂糖凝胶中泳动速度不同。通常凝胶浓度越低,则凝胶孔径越大,DNA电泳迁移速度越快,因此,相对分子质量越大,选用的凝胶浓度应越低。
8、Supercoiled DNA Ladder Marker(浓度:500ng/6μl) 由 8种超螺旋的质粒DNA 构成,DNA Size大小见下表
表1. Supercoiled DNA Ladder Marker DNA size
图2. Supercoiled DNA Ladder Marker
,在Supercoiled DNA Ladder Marker范围中。但不在λDNA/Hind ⅢMaker(125bp-23130bp)的分离范围中,所以不能选用λDNA/Hind ⅢMaker。
【实验试剂与仪器】
1、实验试剂:LB培养基,麦康凯培养基,抗生素(氨苄青霉素),溶液Ⅰ,溶液Ⅱ,溶液Ⅲ,RNase A母液,TE缓冲液,饱和酚,***仿/异戊醇混合液,预冷无水乙醇,1×TAE电泳缓冲液,上样缓冲液(6×loading buffer),琼脂糖,溴化乙锭(EB),Supercoiled DNA Ladder Marker
2、实验仪器:恒温振荡培养箱,高速冷冻离心机,漩涡振荡器,-20
℃冰箱,
,50mL离心管,不同型号枪头,微量移液器,培养皿,微