文档介绍：该【免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)原理 】是由【小s】上传分享，文档一共【9】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)原理 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液。我们以常用的RIPA裂解液为例(,接近
生理浓度下的NaCl,一定比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等)来说明其各主要成份的用途,进而帮助我们如何针对不同的实验目的和不同的蛋白
质特性来选择最佳的裂解液。
:-Cl。
,这主要是因为150mM接近生理浓度,不会破坏蛋白质之间的相互作用。然而细胞内部的NaCl浓度并不是均一
的,局部NaCl的浓度可以低到50mM,150mM的NaCl有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl浓度要视所分析的蛋白的
亚细胞定位而定。
,可以对蛋白质之间的相互作用起到一个很好的保护作用。一般添加10%的甘油有助于稳定蛋白质之间的相互作用。
,也同时破坏了许多细胞器的膜,从而释放了其中储存的许多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀实验的去垢剂作
用比较温和,因此蛋白酶的活性大部分得以保存。还有一部蛋白酶来分自胞质中,主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制环境受到改变后从而恢复了蛋白酶活
性。因此,添加蛋白酶抑制剂对于防止目的蛋白的降解从而完成免疫沉淀实验非常关键。一般主要通过添加EDTA抑制金属蛋白酶,通过ProteaseCocktail
(多种蛋白酶抑制剂混合物)可以抑制蛋白酶。
。不同的去垢剂种类和不同的去垢剂浓度主要通过影响以下三个因素来影
响免疫沉淀效果:
-细胞质/器膜的通透性:因为许多目的蛋白都定位在细胞器中,所以必须先将这些蛋白释放出来,抗体才能与之反应。
-膜蛋白的释放:许多膜蛋白的构象对去垢剂种类和浓度非常敏感,因此针对这类蛋白的免疫沉淀实验,需要谨慎地尝试多种去垢剂以及不同浓度。
-蛋白相互作用:不同去垢剂对不同性质的蛋白质的相互作用影响程度不一样,需要根据具体蛋白的特性进行分析选择去垢剂种类和浓度。而由于何
种去垢剂适应作用于何种蛋白质现在很难精准预测,所以一个更为切实可行的办法就是通过具体实验筛选合适的去垢剂种类和浓度。
二、抗体-agarosebeads孵育
裂解细胞,离心并去除不可溶的膜组份后,上清可以储存在-80°保存3个月,但最好能够使用新鲜制备的细胞裂解液上清去进行抗体-agarosebeads
孵育实验。抗体可以先加入上清中与样品孵育数小时后再加入ProteinA或者Gbeads孵育过夜,也可以同时加入抗体和ProteinA或者Gbeads孵育过夜。
一般选择1mg总蛋白(1mg/ml)对应添加1ug抗体,最高可以添加至5ug抗体,过多的抗体会产生假阳性。这个步骤中关键因素在于选择合适的阴性对
照。一般选用加同样量的IgG,但更为妥当的方法是选择针对胞内其它无关目的蛋白的一抗做对照。例如,做膜蛋白A的免疫沉淀,选择膜蛋白B来做阴性
对照,只要确认二者之间没有相互作用;而做胞质可溶性蛋白C的免疫沉淀,则选择另外一个可溶性蛋白D来做阴性对照。同时,为避免ProteinA或者G
beads有(非)特异性吸附从而造成免疫沉淀实验结果的假阳性,一般在加入目的蛋白抗体之前,预先将ProteinA或者Gbeads与细胞裂解液孵育数小时,
然后取上清用于后续的抗体-agarosebeads孵育。
同时,ProteinA或者Gbeads对不同类型的抗体亲和力不同,结合一抗的种属和Ig亚型,选择合适的ProteinA或者Gbeads也是决定免疫沉淀实
验成功与否的一个重要因素。一般推荐使用ProteinA和ProteinGbeads的混合物,这样可以达到最佳实验效果,而且省去了许多选择的烦恼。
三、抗体-agarosebeads复合物洗涤:
除了选择特异性好的抗体以及选择合适的阴性对照外,去除免疫沉淀实验非特异性的一个办法是对抗体-agarosebeads复合物进行多次洗涤。一般洗
涤缓冲液使用和裂解液一样的配方,但去除甘油,以减少由于甘油的粘性带来的非特异性吸附。针对不同的实验要求,还可以通过更改NaCl的浓度以及去
垢剂的比例,种类来达到去除非特异性吸附的效果。例如,针对单纯的免疫沉淀而非免疫共沉淀实验或者虽然是进行免疫共沉淀实验,但蛋白质之间的结合
比较牢靠,可以考虑使用低浓度(-%)的SDS洗涤抗体-agarosebeads复合物,这样可以去除绝大部分非特异性相互作用。
四、鉴定
免疫沉淀实验用途非常广泛(见IP:Q&A),而且基于最基本的免疫沉淀实验衍生出免疫沉淀相多关实验手段(比如免疫共沉淀,染色质免疫
沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀),因此,免疫沉淀实验的鉴定方法主要视实验目的而定。
我们在本手册中主要简单概述常见的免疫沉淀之后的WB检测需要注意的实验环节。由于免疫沉淀实验使用目的蛋白抗体加ProteinA/Gbeads与样
品孵育,因此在最后离心获得抗体-agarosebeads复合物后,eppendorf管中主要含有抗体,目的蛋白,ProteinA/Gbeads以及一些其它非特异性作用蛋白。
其中,抗体和目的蛋白以及ProteinA/Gbeads三者之间是以非共价健结合在一起,只有ProteinA/G与agarosebeads是共价结合在一起的。因此,最后经
过添加含巯基乙醇的加样缓冲液以及煮沸变性并离心出去ProteinA/Gbeads后,eppendorf管只有抗体和目的蛋白以及少量非特异性吸附蛋白。这样
SDS-PAGE中就含有目的蛋白和抗体二种蛋白,由于加样缓冲液中含有巯基乙醇从而导致抗体的重链与轻链之间的二硫键被破坏从而使得抗体分子变成重链
分子(55KD)和轻链分子(25KD)。因此,WB显色反应中除了能检测到目的蛋白外,如果所使用的二抗与用于免疫沉淀实验的抗体分子属于同一种属的
话,还能检测到重链和轻链分子。通常用于免疫沉淀的抗体量非常大(1ug),所以当目的蛋白的大小接近重链或者轻链分子时,重链或者轻链分子的WB
信号常常由于信号过强而导致影响对目的蛋白的WB结果判断。
针对上述情况,通常有二种解决办法:
,这样再选择一个种属交叉反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行WB实验,就可以
大大减弱重链和轻链分子的WB信号。
染色质免疫共沉淀:染色质免疫沉淀的主要目的通过抗体和目的蛋白的相互作用从而捕获和目的蛋白有相互作用的DN***段,最终检测
目的蛋白和DN***段的相互作用。因此,实验中要注意的关键点和前二者(免疫沉淀和免疫共沉淀)有所不同。因为在实验中中蛋白质-DNA复
合物的维持需要依靠多聚甲醛的交联作用,所以目的蛋白的许多表面表位也在交联过程中丧失。因此,除了后续的基本操作和免疫沉淀以及免疫
共沉淀有些许不同,有额外需要注意的是向外,其对抗体的要求要比免疫沉淀和免疫共沉淀高得多,相对而言,裂解缓冲液的成份并不是关键因
素。
免疫共沉淀和GST-Pulldown有什么区别?
免疫共沉淀实验由于在非变性实验条件性进行,这样蛋白质之间的天相互作用得以最然大程度的保留,因此可以比较真实的反应蛋白质之间的相
互作用。但也基于此点,免疫共沉淀并不能显示蛋白质之间的相互作用是直接还是间接的,因为通过目的蛋白抗体共沉淀下来的是一个蛋白复合
物,而不仅仅是和目的蛋白直接相互作用的蛋白。而GST-Pulldown实验可以通过体外实验条件,去除其它蛋白的影响,从而确定目的蛋白和待
检测蛋白是否可以发生直接相互作用。
免疫沉淀,免疫共沉淀和RNA免疫沉淀以及染色质免疫沉淀一般都用于什么实验目的?
实验名称研究目的研究用途备注
蛋白纯化利用抗体和抗原的特异性结合达到纯化抗原的目的
去除目的蛋白利用抗体和抗原的特异性结合达到从含有抗原的反应液中去除
通过IP可以对目的抗原进行富集(最高可以富集10,000倍),后进行然WB。由于对目的
优化免疫印迹(WB)效
抗原进行了富集,提高了抗原浓度,这样可以解决许多抗体WB实验效果不好(包括特异性
果
不好和背景严重)的问题
研究目的蛋白
免疫沉淀
可以通过免疫沉淀纯化抗原去进行质谱鉴定从而测定蛋白的修饰位点的信息(磷酸化,***化,
的理化特性
测定蛋白修饰位点信息
乙酰化和糖链修饰等)
通过免疫沉淀纯化经由放线菌***处理的细胞样品中的抗原再通过WB测定不同样品中目的抗
测定蛋白的降解速度原的含量;或者对细胞进行同位素脉冲标记然后进行免疫沉淀实验再通过放射自显影测定目的
抗原的含量
测定酶活经免疫沉淀纯化待测酶后再进行酶活测定(包括激酶测定等)
寻找新的相互作用蛋白经由免疫共沉淀后通过质然谱或者WB鉴定新的相互作用蛋白
研究蛋白与蛋
免疫共沉淀
验证目的蛋白和待测蛋经由免疫共沉淀后通过然使用待测蛋白的抗体进行WB实验可以确定目的蛋白和待测蛋白是
白的相互作用
白是否有相互作用否有相互作用
研究蛋白与研究蛋白与DNA的动通过对经由免疫共沉淀而得到的DN***段进行PCR实验可以获得DN***段的序列信息以及
染色质免疫沉淀
DNA的相互作态作用目的蛋白与DNA之间的动态作用信息
用
研究组蛋白的各种共价通过使用针对组蛋白不同修饰位点的抗体进行染色质免疫沉淀实验去检测组蛋白的不同修饰
修饰与基因表达之间的状态和目的基因启动子之间的动态相互作用,从而研究组蛋白修饰与目的基因表达之间的关系
关系
研究蛋白与RNA的相基于CHIP的原理发展出来的RIP(RNA-IP)技术可以用来研究目的蛋白与RNA之间的相互
互作用作用信息
我该选择什么样的抗体做免疫沉淀,免疫共沉淀和RNA免疫沉淀以及染色质免疫沉淀?
在所有免疫沉淀相关实验中,抗原的起始浓度相对其它免疫相关实验(WB和IF等)要低得多,所以对抗体的亲和力相对其它实验(WB和
IF等)提出了很高的要求,这就需要使用高亲和力的抗体去进行免疫沉淀相关实验。同时,由于免疫沉淀相关实验主要是在生理条件性进行,所以
需要抗体识别蛋白的天然表面构象,因此选择的抗体其针对的抗原决定蔟需要暴露在蛋白表面。这些因素对制备能成功应用于IP实验的抗体提出
了很高的要求:
。获得接近天然构象的蛋白抗
原的途径有很多,主要有天然提取,原核表达重组蛋白以及真核表达重组蛋白三种方式。这其中,就蛋白构象角度而言,天然提取是最佳途径,
但这种方法受材料来源限制和纯化方法复杂等多因素影响,一般很少采用。原核表达因为成本低廉,操作方便最为受欢迎,但其受表达环境与
大部分蛋白天然存在环境差别巨大,构象失真情况严重,抗原的构象质量有严重问题。大规模瞬时真核表达是近期新兴的表达系统,具有表达
环境接近天然,操作方便等诸多优点,是获取具有天然构象蛋白抗原的首选工具。
。多克隆抗体由于可以结合目的抗原的多个抗原决定簇,所以在亲和力方面是首选。但考虑到特异性,
得获单克隆抗体群是更好的选择。具体优缺点总结如下表。
单克隆抗体群(由一个免疫原产生的多个单克隆抗体混合
多克隆抗体单克隆抗体
物)
抗体抗原作用信号
极佳由抗体的亲和力决定(极佳或者极弱)极佳
强度
通常很好,但有时会有非特异性极佳(由于选择可以进行IP且没有交叉反应的抗体组成
特异性极佳,但有时会有交叉反应
相互作用单克隆抗体群)
亲和力高(由于抗体可以与目的
特异性好,亲和力高(由于选择可以进行IP且没有交叉
优点蛋白的多个抗原决定蔟相互作特异性好,且可以无限量供应
反应的抗体组成单克隆抗体群)
用)
需要筛选亲和力高的抗体;抗原表位可能够筛选得到的符合条件的单克隆并不多,所以单克隆抗
缺点非特异性相互作用很难去除
能会被相互作用蛋白遮蔽体群也就不容易获得
极佳(由于选择可以进行IP且没有交叉反应的抗体组成
免疫沉淀效果极佳(由于亲和力高)由抗体的亲和力决定(极佳或者极弱)
单克隆抗体群)
通常很好,但有时非特异性相互由抗体的亲和力决定和抗原表位是否被极佳(由于选择可以成功进行IP且没有交叉反应的抗体
免疫共沉淀效果
作用会带来假阳性相互作用蛋白遮蔽决定(极佳或者极弱)组成单克隆抗体群)
染色质免疫沉淀效通常很好,但有时非特异性相互由抗体的亲和力决定和抗原表位是否被极佳(由于选择可以成功进行IP且没有交叉反应的抗体
(比如RIPA缓冲液)
(大于150nMNaCl)或者其它强表面活性剂洗脱
目的蛋白大小与IgG的使用不同种属的抗体分别进行IP和WB实验
重链和轻链接近,影响检
使用交联剂DSS将一抗与ProteinA/G-beads共价偶联后进行免疫沉淀
测
实验
免疫共沉淀
产生的问题产生问题的原因解决办法
裂解液中的去垢剂浓度过高或者配方降低去垢剂浓度或者更换去垢剂种类(按作用剧烈程度来区分:
过于剧烈SDS>Trition>NP40>Digitonin>CHAPS)
没有检测到与目的蛋白相互作用的蛋白受蛋白的亚细胞定位影响重新选择裂解液配方以释放目的蛋白
或者检测得到的信号太弱
选择亲和力更高的抗体以捕获更多的目的蛋白从而捕获更多的相互作
蛋白与蛋白之间的相互作用太弱或者
用蛋白;过表达提高目的蛋白的含量;选择目的蛋白或者相互作用蛋白含
不太稳定
量高的样品进行免疫共沉淀实验
假阳性太大,有太多非特异性相互作用蛋抗体浓度过高降低抗体作用浓度
白被检测到
抗体特异性不好更换抗体
染色质免疫沉淀
产生的问题产生问题的原因解决办法备注
没有检测到与目的蛋白相互作用的超声(X-CHIP)或者酶解(N-CHIP)片
染色体片段太小
DM***段或者检测到的信号太弱段不要小于500bp
严格按照protocol进行操作,多聚甲醛多度交联会导致更多的抗原表位被破
过度交联
交联时间控制在10-15min坏,影响抗体与目的蛋白的结合
用于实验的染色体量不够不要少于25ug
当目的蛋白和DN***段之间的相互作组蛋白与DN***段之间的作用比较
使用N-CHIP方法去进行实验
用比较弱时改用X-CHIP方法强,可以使用N-CHIP方法
使用多抗或者单克隆抗体群或者更换合多聚甲醛交联会破坏许多抗原表位使
使用了不合适的单抗
适的单抗得某些单抗的作用效果会减弱
目的蛋白没有与待测DN***段结
使用阳性对照判断CHIP实验是否成功
合
PCR实验失败(引物设计不合理
重新设计引物或者摸索最佳PCR条件
或者PCR反应条件不佳)
抗体浓度过高降低抗体作用浓度
假阳性太大,有太多非特异性结合
抗体特异性不好更换抗体
DN***段被检测到
PCR污染重新配置PCR缓冲液