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橙皮苷调控Jagged1 ...细支气管炎小鼠肺损伤的影响 赵兴艳.pdf

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中国医学科学院学报
ACTAACADEMIAEMEDICINAESINICAE
·论 著·
橙皮苷调控Jagged1/Notch1通路对巨噬细胞极化及
细支气管炎小鼠肺损伤的影响
赵兴艳,汤正珍,岳 春,谭宗苹,黄 波
遵义医科大学第三附属医院 遵义市第一人民医院儿科,贵州遵义563000
通信作者:黄 波 电话:0851223235183,电子邮件:******@qqcom
摘要:目的 探究橙皮苷对呼吸道合胞病毒(RSV)细支气管炎模型小鼠肺损伤的影响及可能的作用机制。方法 构
建RSV细支气管炎小鼠模型,采用随机数字表法将60只BALB/c小鼠分为对照组、模型组、低剂量橙皮苷组(18mg/kg)、
高剂量橙皮苷组(36mg/kg)、高剂量橙皮苷(36mg/kg)+Jagged1(1mg/kg)组,每组12只,给予相应剂量的药物进行
干预,对照组和模型组给予等量生理盐水。收集小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF),并分离肺泡巨噬细胞;ELISA检测
BALF中白细胞介素(IL)4、IL6、肿瘤坏死因子α(TNFα)、IL10的水平;流式细胞术检测巨噬细胞M1/M2型极化;
qRTPCR、Westernblot检测肺组织诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶1(Arg1)、Jagged1和Notch1的mRNA和蛋白
表达水平。结果 与对照组相比,模型组小鼠BALF中IL4、IL6、TNFα、M1型巨噬细胞比例、肺组织炎症评分和黏液
分泌评分以及iNOS、Jagged1、Notch1mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P均<0001),而IL10、M2型巨噬细胞比例、
Arg1mRNA和蛋白表达水平显著降低(P均<0001);与模型组相比,低、高剂量橙皮苷组小鼠BALF中IL4、IL6、
TNFα、M1型巨噬细胞比例、肺组织炎症评分和黏液分泌评分以及iNOS、Jagged1、Notch1mRNA和蛋白表达水平显著降
低(P均<005),而IL10、M2型巨噬细胞比例、Arg1mRNA和蛋白表达水平显著升高(P均<0001);使用重组Jagged1
蛋白激活Notch1信号通路可显著减弱高剂量橙皮苷对M2型巨噬细胞极化的促进作用和对肺部炎症损伤的改善作用(P均<
001)。结论 橙皮苷可减轻RSV诱导的细支气管炎小鼠肺部炎症损伤,其作用机制可能与抑制Jagged1/Notch1通路,促
进巨噬细胞M2型极化有关。
关键词:橙皮苷;呼吸道合胞病毒;细支气管炎;巨噬细胞极化;Jagged1/Notch1通路
中图分类号:R7256 文献标志码:A 文章编号:1000503X(2022)04054508
DOI:103881/jissn1000503X14888
HesperidinRegulatesJagged1/Notch1PathwaytoPromoteMacrophagePolarization
andAlleviateLungInjuryinMicewithBronchiolitis
ZHAOXingyan,TANGZhengzhen,YUEChun,TANZongping,HUANGBo
DepartmentofPediatrics,theThirdAffiliatedHospitalofZunyiMedicalUniversity,theFirstPeople’sHospitalofZunyi,
Zunyi,Guizhou563000,China
Correspondingauthor:HUANGBo Tel:0851223235183,Email:******@qqcom
ABSTRACT:Objective Toexploretheeffectandmechanismofhesperidinintreatingthelunginjuryin
themousemodelofrespiratorysyncytialvirus(RSV)inducedbronchiolitisMethods AmousemodelofRSV
inducedbronchiolitiswasestablished,and60BALB/cmicewereassignedintoacontrolgroup,amodelgroup,
alowdosehesperidin(18mg/kg)group,ahighdosehesperidin(36mg/kg)group,andahighdosehesperi
基金项目:遵义市科技计划项目(遵市科合社字[2018]179号)SupportedbytheScienceandTechnologyProjectofZunyiCity(zskhsz[2018]No179)
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中国医学科学院学报
din(36mg/kg)+Jagged1(1mg/kg)groupbyrandomnumbertablemethod,with12miceineachgroup
Correspondingdosesofdrugswereadministratedforintervention,andthecontrolgroupandmodelgroupweread
ministratedwiththesameamountofsalineThebronchoalveolarlavagefluid(BALF)sampleswerecollectedand
alveolarmacrophageswereisolatedELISAwasemployedtodetectthelevelsofinterleukin(IL)4,IL6,tumor
necrosisfactorα(TNFα),andIL10inBALF,andflowcytometrytodetecttheM1/M2polarizationofmacro
phagesqRTPCRandWesternblottingwererespectivelyconductedtodetectthemRNAandproteinlevelsofin
duciblenitricoxidesynthase(iNOS),arginase1(Arg1),Jagged1,andNotch1inthelungtissueResults
Comparedwiththecontrolgroup,themodelingofRSVinducedbronchiolitiselevatedtheIL4,IL6,andTNF
αlevels,increasedtheproportionofM1typemacrophagesandthelunginflammationandmucussecretion
scores,andupregulatedthemRNAandproteinlevelsofiNOS,Jagged1,andNotch1inBALF(allP<
0001)Meanwhile,themodelingloweredtheIL10level,decreasedtheproportionofM2typemacrophages,
anddownregulatedthemRNAandproteinlevelsofArg1(allP<0001)Comparedwiththemodelgroup,
lowandhighdosehesperidinloweredtheIL4,IL6,TNFαlevels,decreasedtheproportionofM1typemac
rophagesandthelunginflammationandmucussecretionscores,anddownregulatedthemRNAandproteinlev
elsofiNOS,Jagged1,andNotch1inBALF(allP<005)Moreover,hesperidinelevatedtheIL10level,in
creasedtheproportionofM2typemacrophages,andupregulatedthemRNAandproteinlevelsofArg1(all
P<0001)UsingrecombinantJagged1proteintoactivateNotch1signalingpathwaycansignificantlyattenuate
thepromotionofhighdosehesperidinonM2macrophagepolarizationandameliorationoflunginflammationdam
age(allP<001)Conclusion HesperidinmayalleviatethelunginflammationdamageinmicewithRSVin
ducedbronchiolitisbyinhibitingtheJagged1/Notch1signalingpathwayandpromotingtheM2typepolarizationof
macrophages
Keywords:hesperidin;respiratorysyncytialvirus;bronchiolitis;macrophagepolarization;Jagged1/Notch1pathway
ActaAcadMedSin,2022,44(5):545552
细支气管炎是一种常见且较严重的小儿急性下呼信号通路可明显改善气道炎症。橙皮苷是一种具有广
吸道感染性疾病,呼吸道合胞病毒(respiratorysyncy泛生物学活性的天然酚类化合物[1012]。研究表明,橙
tialvirus,RSV)是其主要病原体,该疾病的特点是气皮苷作为潜在的Th2细胞因子拮抗剂,具有抗哮喘作
道炎症、黏液分泌增多,有时还会出现气道上皮细胞用,可降低炎症细胞和Th2细胞因子的数量,抑制卵
坏死[1]。据估计,有RSV细支气管炎病史的个体患哮清蛋白诱导的气道炎症[1314]。然而,橙皮苷对RSV引
喘的风险要高2~12倍[2]。肺泡巨噬细胞在RSV感染起的细支气管炎是否具有保护作用尚不清楚。因此,本
引起的肺损伤疾病进展中起到关键作用[3]。有研究显研究通过构建RSV细支气管炎小鼠模型,探究橙皮苷
示,细支气管炎患儿血清巨噬细胞炎性蛋白1α、单核对细支气管炎小鼠肺损伤的影响及可能的作用机制。
细胞趋化蛋白1和白细胞介素(interleukin,IL)4水
平升高,且与疾病的严重程度密切相关[45]。RSV感材料和方法
染呼吸道上皮细胞可引起细胞因子和趋化因子如单核
细胞趋化蛋白1、IL6、肿瘤坏死因子α(tumornecro主要试剂与仪器 橙皮苷(纯度>95%,货号:
sisfactorα,TNFα)和IL1β水平的上调以及炎症细C006)购自成都瑞芬思生物科技有限公司;RSV购
胞聚集到肺部,而巨噬细胞向M2亚型极化会减轻自山东省医药生物技术研究中心;人宫颈癌HeLa细胞
Th2炎症反应[6],其机制可能与激活Jagged1/Notch1购自武汉普诺赛生命科技有限公司;重组小鼠Jagged1
通路促进气道微环境中Th2淋巴细胞的分化有关[7]。蛋白(货号:ab109346)购自英国Abcam公司;BCA
Notch信号通路是介导巨噬细胞极化的关键通路,激试剂盒(货号:P0012S)购自上海碧云天生物技术有
活Notch信号通路促进巨噬细胞向M1型极化,并阻限公司;小鼠IL6(货号:ml002293)、TNFα(货
碍其向M2型极化[8]。Zeng等[9]研究显示抑制Notch号:ml002095)、IL10(货号:ml002285)、IL4(货
5 46 &'(')*,+,++
橙皮苷调控Jagged1/Notch1通路对巨噬细胞极化及细支气管炎小鼠肺损伤的影响
号:ml063156)ELISA试剂盒均购自上海酶联生物科于-20℃保存,同时将沉淀的细胞用含10%胎牛血清
技有限公司;兔抗CD11bFITC抗体(货号:561688)、和1%双抗(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)
F4/80PerCPCy55抗体(货号:567202)、CD86PE的DMEM/F12培养基重悬,置于37℃、5%CO2饱和
抗体(货号:561963)均购自美国BDBioscience公湿度的培养箱中培养。
司;CD206APC抗体(货号:PA546879)、诱导型一ELISA检测BALF中炎症相关因子水平 取-20℃
氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)抗保存的各组小鼠BALF上清液,按照ELISA试剂盒说
体(货号:PA3030A)、精氨酸酶1(arginase1,Arg1)明书检测IL6、IL10、IL4、TNFα的表达水平。
抗体(货号:PA585267)、Jagged1抗体(货号:PA5流式细胞术检测巨噬细胞M1/M2型极化 取原代
86057)、Notch1抗体(货号:MA532080)、GAPDH小鼠肺泡巨噬细胞调整浓度为1×107个/ml细胞悬液,
抗体(货号:PA116777)、山羊抗兔IgG(H+L)抗4%多聚甲醛固定15min。分别加入兔抗CD11bFITC
体(货号:A32734)均购自美国ThermoScientific公抗体(10μl)、F4/80PerCPCy55抗体(10μl)、
司。FACSCantoⅡ流式细胞仪购自美国BD公司;BX61CD86PE抗体(10μl)和CD206APC抗体(10μl)
电动显微镜购自日本Olympus公司。4℃避光孵育10min。采用流式细胞仪检测M1和M2
RSV混悬液的制备 将RSV冻存液于37℃快速型巨噬细胞的比例。M1型巨噬细胞为F4/80、CD11b、
融化,按照005病毒感染复数计算病毒接种量,接种CD86表达阳性,而CD206呈阴性表达;M2型巨噬细
于Hela细胞上,收集感染病毒的细胞,在-80℃冰胞为F4/80、CD11b、CD206表达阳性,而CD86呈阴
箱中反复冻融3次,然后在4℃下以1000r/min(r=性表达。
135cm)的速率离心10min,取上清液,空斑法测定HE染色与过碘酸希夫染色 小鼠处死后取出肺
病毒滴度,并调整病毒滴度为1×106PFU/ml,置于组织,4%多聚甲醛固定24h后石蜡包埋、切片,常
-80℃冰箱中保存备用。规HE染色,评估气道周围炎症细胞的浸润情况。采
实验动物与分组 6~8周龄SPF级BALB/c雄性用5级评分标准:0分:无炎症;1分:少量炎症细胞
小鼠60只(体重18~22g)购自济南朋悦实验动物浸润;2分:炎症细胞形成环状,1个细胞层深,肺
繁殖有限公司,合格证号为SCXK(鲁)20190003。泡壁轻度增厚;3分:炎症细胞形成环状,2~4个细
在标准条件下进行喂养,保持12h光照/12h黑暗循胞层深,肺泡壁显著增厚;4分:炎症细胞形成环状,
环,温度(25±2)℃,湿度50%~70%,自由进食超过4个细胞层深,肺泡壁显著增厚。采用过碘酸希
和饮水。参照文献[15]方法制备细支气管炎小鼠模夫(periodicacidSchiff,PAS)染色评估杯状细胞分
型:于小鼠两侧鼻内滴入100μlRSV混悬液,对照组泌黏液的情况。评分标准:0分:阴性或染色面积<
于相同部位滴入100μlHela细胞培养液,1次/d,连滴5%;1分:染色面积5%~25%;2分:染色面积26%~
2d,第3天观察到滴入RSV混悬液的小鼠出现咳喘、50%;3分:染色面积51%~75%;4分:染色面积>75%。
呼吸急促、活动减少,且口唇和四肢发绀的现象,说明qRTPCR检测肺组织iNOS、Arg1、Jagged1和Notch1
模型制备成功。采用随机数字表法将60只BALB/c小鼠mRNA的表达 qRTPCR测定肺组织iNOS、Arg1、
分为对照组、模型组、低剂量橙皮苷组(18mg/kg)、高Jagged1、Notch1mRNA的表达,引物序列见表1。采
剂量橙皮苷组(36mg/kg)[16]、高剂量橙皮苷(36mg/用Trizol法提取肺组织总RNA,使用逆转录试剂盒将
kg)+Jagged1(1mg/kg)组[17],每组12只。低、高RNA反转录为cDNA,进行PCR扩增,以GAPDH为
剂量橙皮苷组小鼠分别灌胃18、36mg/kg橙皮苷,高内参进行相对定量。反应条件:95℃预变性10min,
剂量橙皮苷+Jagged1组小鼠在灌胃36mg/kg橙皮苷1个循环;95℃10s、60℃20s、72℃34s,40个循
的同时腹腔注射1mg/kgJagged1,对照组与模型组小环。采用2-ΔΔCt法计算相对定量值。ΔΔCt=ΔCt(实
鼠灌胃等量生理盐水,1次/d,连续给药7d。验组)-ΔCt(对照组),其中ΔCt=目的基因Ct-内
肺泡巨噬细胞分离 小鼠使用10%水合***醛麻醉,参基因Ct。
暴露气管并在中间切开,通过气管插管用08ml无菌Westernblot检测肺组织iNOS、Arg1和Jagged1/
PBS灌洗肺3次,并收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalNotch1通路相关蛋白的表达 使用含有1%蛋白酶抑
veolarlavagefluid,BALF),每只小鼠约15ml。以制剂的RIPA裂解液制备肺组织裂解物,提取总蛋白,
1500r/min(r=135cm)转速离心10min,取上清液BCA法测定蛋白浓度。在10%SDSPAGE上分离等量蛋
!"#$$%"$ 5 47
中国医学科学院学报
表1 qRTPCR引物序列pg/ml;q=27906,P<0001]水平显著降低,IL10水平
Table1 PrimersequencesforqRTPCR显著升高[(204±023)pg/ml比(137±021)pg/ml;
引物名称Primername序列(5′3′)Primersequence(5′3′)q=9599,P<0001和(252±027)pg/ml比(137±
诱导型一氧化氮合酶F:CCCTTCAATGGTTGGTACATGG021)pg/ml;q=16476,P<0001];与高剂量橙皮
InduciblenitricoxidesynthaseR:CATTGATCTCCGTGACAGCC
苷组相比,高剂量橙皮苷+Jagged1组小鼠BALF中
精氨酸酶1F:CATGGGCAACCTGTGTCCTT
Arginase1R:CGATGTCTTTGGCAGATATGCAIL4[(254±025)pg/ml比(186±024)pg/ml;
Jagged1F:GCTACTACTGCGACTGTCTTCCCGq=9352,P<0001]、IL6[(3598±341)pg/ml
R:AGATACAGCGATAACCATTAACCAAA比(2361±255)pg/ml;q=13983,P<0001]、
Notch1F:GTCAACGCCGTAGATGACCTTNFα[(3221±341)pg/ml比(2163±252)
R:TTGTTAGCCCCGTTCTTCAGpg/ml;q=11661,P<0001]水平显著升高,IL10水
GAPDHF:GTCGATGGCTAGTCGTAGCATCGAT平显著降低[(191±01)pg/ml比(252±027)
R:TGCTAGCTGGCATGCCCGATCGATC
pg/ml;q=8740,P<0001]。
M1/M2型巨噬细胞比例 与对照组相比,模型组
白质(30μg/孔),转膜,分别加入一抗iNOS(1∶1000)、
Arg1(1∶1000)、Jagged1(1∶500)、Notch1(1∶500)、小鼠M1型巨噬细胞比例显著升高[(3100±246)%
GAPDH(1∶2000)4℃孵育过夜,洗涤后再加入辣根比(052±007)%;q=51061,P<0001],M2型
过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶4000),室温孵育巨噬细胞比例显著降低[(512±070)%比(1495±
1h,采用ECL化学发光法显色,利用ImageJ软件分162)%;q=22699,P<0001];与模型组相比,
析蛋白条带灰度值。以GAPDH为内参,计算目的条低、高剂量橙皮苷组小鼠M1型巨噬细胞比例显著降
带的相对表达水平。低[(2024±215)%比(3100±246)%;q=
统计学处理 采用SPSS220统计软件,符合正18025,P<0001和(1161±189)%比(3100±
态分布的计量资料以均值±标准差表示,多组间比较246)%;q=32483,P<0001],M2型巨噬细胞比
采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNKq检例显著升高[(1256±137)%比(512±070)%;
验。P<005为差异有统计学意义。q=17180,P<0001和(2080±215)%比(512±
070)%;q=36208,P<0001];与高剂量橙皮苷
结 果组相比,高剂量橙皮苷+Jagged1组小鼠M1型巨噬细
胞比例显著升高[(1853±267)%比(1161±
BALF中IL6、TNFα、IL4、IL10的表达水平189)%;q=11593,P<0001],M2型巨噬细胞比
与对照组相比,模型组小鼠BALF中IL4[(365±例显著降低[(1142±128)%比(2080±215)%;
029)pg/ml比(087±013)pg/ml;q=38234,P<q=21660,P<0001](图1)。
0001]、IL6[(5407±372)pg/ml比(1136±肺组织病理变化 HE和PAS染色结果显示,与
204)pg/ml;q=48280,P<0001]、TNFα[(4695±对照组相比,模型组小鼠肺组织炎症细胞数量明显增
421)pg/ml比(1042±155)pg/ml;q=40261,P<多,伴有大量的支气管周围炎症细胞浸润和杯状细胞
0001]水平显著升高,IL10水平显著降低[(137±增生,且黏液分泌增加,炎症评分(326±035比0;
021)pg/ml比(256±030)pg/ml;q=17049,P<q=45078,P<0001)和黏液分泌评分(234±
0001];与模型组相比,低、高剂量橙皮苷组小鼠BALF025比0;q=44182,P<0001)显著升高;与模型
中IL4[(277±031)pg/ml比(365±029)pg/ml;组相比,低、高剂量橙皮苷组小鼠肺组织支气管周围炎
q=12103,P<0001和(186±024)pg/ml比(365±症细胞浸润和杯状细胞增生明显减轻,黏液分泌减少,
029)pg/ml;q=24619,P<0001]、IL6[(3853±炎症评分(245±028比326±035;q=11200,P<
329)pg/ml比(5407±372)pg/ml;q=17567,0001和162±020比326±035;q=22677,P<
P<0001和(2361±255)pg/ml比(5407±372)0001)和黏液分泌评分(182±021比234±025;
pg/ml;q=34432,P<0001]、TNFα[(3408±336)q=9818,P<0001和129±016比234±025;
pg/ml比(4695±421)pg/ml;q=14185,P<q=19825,P<0001)显著降低;与高剂量橙皮苷
0001和(2163±252)pg/ml比(4695±421)组相比,高剂量橙皮苷+Jagged1组小鼠肺组织炎症评分
5 48 &'(')*,+,++
橙皮苷调控Jagged1/Notch1通路对巨噬细胞极化及细支气管炎小鼠肺损伤的影响
(231±027比162±020;q=9541,P<0001)和黏0001和184±026比332±040;q=17281,P<
液分泌评分(175±019比129±016;q=8685,0001)mRNA表达水平显著降低,而Arg1mRNA表达水
P<0001)显著升高(图2)。平显著升高(062±007比037±006;q=11785,P<
肺组织iNOS、Arg1、Jagged1和Notch1mRNA表达0001和124±011比037±006;q=41012,P<0001);
水平 与对照组相比,模型组小鼠肺组织iNOS(241±与高剂量橙皮苷组相比,高剂量橙皮苷+Jagged1组小鼠肺
028比100±000;q=23913,P<0001)、Jagged1(285±组织iNOS(181±022比132±017;q=8310,P<
033比100±000;q=28028,P<0001)和Notch1(332±0001)、Jagged1(209±025比146±018;q=9545,P<
040比100±000;q=27089,P<0001)mRNA表达水平0001)和Notch1(263±030比184±026;q=9224,
显著升高,而Arg1mRNA表达水平显著降低(037±P<0001)mRNA表达水平显著升高,而Arg1mRNA
006比100±000;q=29699,P<0001);与模型表达水平显著降低(059±008比124±011;q=
组相比,低、高剂量橙皮苷组小鼠肺组织iNOS(189±30641,P<0001)。
023比241±028;q=8819,P<0001和132±017比肺组织iNOS、Arg1、Jagged1和Notch1蛋白表达
241±028;q=18486,P<0001)、Jagged1(221±水平 与对照组相比,模型组小鼠肺组织iNOS(045±
024比285±033;q=9696,P<0001和146±006比012±002;q=24828,P<0001)、Jagged1(063±
018比285±033;q=21059,P<0001)和008比026±004;q=21542,P<0001)、和Notch1(081±
Notch1(270±035比332±040;q=7239,P<011比040±007;q=24828,P<0001)蛋白表达水平显
图1 流式细胞仪测定M1和M2型巨噬细胞的比例
Fig1 ProportionsofM1andM2typemacrophagesdeterminedbyflowcytometry
图2 HE与过碘酸希夫染色检测肺组织病理变化(×200)
Fig2 PathologicalchangesinlungtissuedetectedbyHEandperiodicacidSchiffstaining(×200)
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中国医学科学院学报
著升高,而Arg1蛋白表达水平显著降低(011±003
比029±005;q=1