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doi:.1000-
赏食兼用百合京鹤高效组培再生体系的优化
祁先宇1☆ 张文亮1,2☆ 杨盼盼1 徐雷锋1* 明 军1*
(1中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京100081;2沈阳农业大学生物科学技术学院,辽宁沈阳110866)
摘 要:百合是重要的高档蔬菜和观赏花卉,基于鳞片的高效组织培养再生体系是百合种球规模化生产繁育的基础。本试
验首次使用草甘膦为诱导分化剂,优化赏食兼用百合品种京鹤鳞片外植体的组培再生体系。结果表明:京鹤鳞片不定芽最
佳诱导培养基为MS+·L-1 6-BA+·L-1NAA+·L-1草甘膦+30g·L-1蔗糖,,显著
高于常规诱导培养;最佳继代增殖培养基为MS+·L-1 6-BA+·L-1NAA+30g·L-1蔗糖,;
最佳鳞茎膨大培养基为MS+90g·L-1蔗糖;最佳生根培养基为1/2MS+·L-1NAA+30g·L-1蔗糖,生根系数为
。
关键词:百合;京鹤;组织培养;草甘膦;诱导分化;高效繁殖
百合(Liliumspp.)是具有较高营养价值的高织培养中,鳞茎不定芽的分化培养是提高百合组
档蔬菜,也是观赏花卉,还是我国重要的药用植物培苗繁殖系数的关键步骤。常规的不定芽诱导分
(龙雅宜和张金政,1998)。京鹤是中国农业科学化是依据百合品种差异选用不同的细胞分裂素与
院蔬菜花卉研究所选育的具有自主产权的赏食兼用生长素,不定芽诱导率较低,%~%
型优质百合品种,不仅抗逆性较强,而且鳞茎营养之间(苏菁华,2014;Islamet al.,2017;Sharifi
成分和生物活性物质含量也较高,具有很高的经济et al.,2017;陈姝男,2018;张旭红等,2018;
价值,亟须进行大规模繁殖示范推广(袁素霞等,Gaoet al.,2018;Mohebodiniet al.,2018;Sahoo
2016)。et al.,2018;李茂娟等,2019;李卓忆,2019;张
分球繁殖和鳞片扦插是百合生产上常用的繁殖文婷等,2019;Royandazagh,2019;符勇耀等,
方式,但是这些繁殖方式繁殖系数低,且易积累病2020;Patilet al.,2021;Yanget al.,2021)。
毒,影响百合的产量和品质(马生军等,2018)。草甘膦作为目前使用最广泛、安全的除草剂
植物组织培养是一种可以保障作物品种优良特性的之一(Krimsky,2022),虽然其作用机制的研究
高效、现代化、工厂化原种生产方法。在百合组已经比较清楚(Amrheinet al.,1980;Stephen,
2019),但是目前未见草甘膦在百合及其他植物组
织培养再生方面的研究报道。中国农业科学院蔬菜
☆为同等贡献作者
祁先宇,男,硕士,专业方向:百合组织培养,E-mail:460363981@花卉所百合课题组前期在抗草甘膦转基因京鹤百合
;张文亮,男,硕士研究生,专业方向:百合栽培,E-mail:的试验研究中,发现低浓度草甘膦对京鹤鳞片不定
******@,且诱导率显著高于常
*通信作者(Correspondingauthors):明军,男,研究员,专业方向:
规组织培养再生分化体系;本课题组虽然建立了常
百合种质资源与遗传育种,E-mail:******@;徐雷锋,
男,助理研究员,专业方向:百合种质资源与遗传育种,E-mail:规的京鹤不定芽诱导体系,但诱导系数()、
******@()仍不高,且没有进行鳞茎增殖
收稿日期:2021-12-10;接受日期:2022-06-10方面的试验。因此,本试验首次使用草甘膦为诱导
基金项目:国家重点研发计划项目(,
2019YFD1001805分化剂,以鳞片为外植体,优化京鹤高效组培再生
2018YFD1000405),中央级公益性科研院所基本科研业务费专项
体系,以期为百合鳞片不定芽诱导、组培苗生产提
(IVF-BRF2020019),贵州省科技计划项目〔黔科合成果(2019)
4235〕供理论参考。
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研究论文中国蔬菜CHINAVEGETABLES
培养基的基础上,设置4个蔗糖浓度处理:Z1,30
1 材料与方法-1-1-1
g·L;Z2,60g·L;Z3,90g·L;Z4,120g·
试验材料L-1。将上一试验最佳条件下得到的直径1cm左右
试验于2018年4月在中国农业科学院蔬菜花的小鳞茎转接至不同蔗糖浓度的培养基中,每处理
卉研究所进行。供试百合品种京鹤为中国农业科学3次生物学重复,每重复接种30个小鳞茎;置于
院蔬菜花卉研究所自主培育,所选材料为秋季采收室温25℃、暗培养条件下进行鳞茎膨大培养,30
的生长健壮、无病虫害的种球中层鳞片,种球直径d后转接1次,60d后统计各鳞茎的直径。
10~15cm。试验用草甘膦(Glyphosate) NAA对京鹤膨大鳞茎生根的影响 在
95%(德国,Sigma,P9556-5G)。1/2MS+30g·L-1蔗糖培养基的基础上,设置4个
试验方法NAA浓度处理:CK2,0mg·L-1;G1,·L-1;
采用MS固体培养基〔MS基本培养基(含维G2,·L-1;G3,·L-1。将最佳条件下
-
生素),琼脂7g·L1,〕,于121℃条件膨大培养60d后的鳞茎接种到添加不同浓度NAA
下灭菌20min。培养室温度为(25±1)℃,暗培养。的生根培养基中,每处理3次生物学重复,每重
草甘膦诱导京鹤鳞片不定芽试验 以本课题复接种30个膨大鳞茎;置于室温25℃条件下进行
-
组已有的京鹤不定芽分化培养基(MS+·L1暗培养,30d后统计所有鳞茎的总根数,计算生根
6-BA+·L-1NAA+30g·L-1蔗糖)为基础,系数。
-
设置4个草甘膦浓度处理:CK1,0mg·L1;T1,=总根数/接种的鳞茎数
---
mg·L1;T2,·L1;T3,·L1。 数据处理
京鹤健康种球鳞片,洗净后用10%次***酸钠溶液利用MicrosoftExcel软件进行试验数据分析,
浸泡灭菌15min,再用无菌蒸馏水清洗3遍,。
用解剖刀切割成1cm×1cm的小方块,接种于添
结果与分析
加不同浓度草甘膦的分化培养基上。每处理3次生2
物学重复,每重复接种30个外植体; 草甘膦对京鹤鳞片不定芽诱导分化的效果
℃条件下进行暗培养,40d后统计不定芽数,计算不同浓度的草甘膦对京鹤鳞片不定芽的诱导分
不定芽诱导系数。化有显著影响,鳞片内侧密集分化产生了大量小仔
不定芽诱导系数=不定芽数/接种的外植体数球,而常规的不定芽分化培养基处理(CK1)只是
6-BA、NAA对京鹤不定芽增殖的影响 鳞在伤口处形成小仔球(图1)。
片接种培养40d后,将上一试验最佳条件下诱导从表1可以看出,T1处理的诱导系数最高,
产生的不定芽转接到添加不同浓度6-,显著高于其他处理;其次是CK1和T2处
的培养基中进行增殖培养(MS+30g·L-1蔗糖)。理,T3处理最低。据观察,T2和T3处理的部分
设置6个6-BA与NAA浓度处理组合:J1,·
L-1 6-BA+·L-1NAA;J2,·L-1 6-BA
+·L-1NAA;J3,·L-1 6-BA+
mg·L-1NAA;J4,·L-1 6-BA+·L-1
NAA;J5,·L-1 6-BA+·L-1NAA;
J6,·L-1 6-BA+·L-1NAA。每处理3
次生物学重复,每重复接种30个外植体;置于室
温25℃、暗培养条件下进行增殖培养,60d后统
CK1T1
计再生成的小鳞茎数,计算不定芽增殖系数。
图1 草甘膦对京鹤单个鳞片不定芽的诱导分化
增殖系数=再生小鳞茎数/接种外植体数
CK1,草甘膦浓度为0mg·L-1;T1,·L-1。
蔗糖对京鹤不定芽鳞茎膨大的影响 在MS标尺为1cm,下图同。
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中国蔬菜CHINAVEGETABLES研究论文
外植体有褐化死亡的情况,尤其是T3处理,褐化表1 不同浓度草甘膦诱导分化京鹤鳞片不定芽的效果
-1
死亡率较高(图2)。由此可见,低浓度草甘膦对处理草甘膦/mg·L诱导系数
±
京鹤不定芽分化具有显著的促进作用,随着浓度升
±
高,不定芽诱导受到阻碍,甚至出现褐化死亡现象。±
因此,·L-±
京鹤鳞片诱导不定芽。注:表中同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著(P<
),下表同。
6-BA和NAA对京鹤不定芽的增殖效果
从表2可以看出,不同浓度的6-BA和NAA
对京鹤不定芽增殖系数无显著影响,表明京鹤在
不定芽增殖期对6-BA和NAA不敏感(图3)。
J1处理不定芽增殖系数最大,6-BA与NAA用量
CK1T1
较低,定为本次试验京鹤鳞片不定芽增殖的最适
组合。
表2 不同浓度6-BA和NAA对京鹤不定芽增殖的影响
处理6-BA/mg·L-1NAA/mg·L-1增殖系数
±
±
±
图2 ±
CK1,草甘膦浓度为0mg·L-1;T1、T2、T3,±
、、·L-1。±
J1J2J3
J4J5J6
图3 不同浓度6-BA和NAA对京鹤不定芽增殖的影响
J1,6-、·L-1;J2,6-、·L-1;J3,6-、
mg·L-1;J4,6-、·L-1;J5,6-、·L-1;J6,6-、
·L-1。
—59—
研究论文中国蔬菜CHINAVEGETABLES
蔗糖对京鹤不定芽鳞茎膨大的影响
-1 讨论与结论
从表3可以看出,在蔗糖浓度为30~90mg·L3
时, 草甘膦在京鹤鳞片不定芽分化中的作用
大;当蔗糖浓度为90mg·L-1时,平均鳞茎直径达前人已经建立了多种百合的组织培养再生体
-
;而当蔗糖浓度为120mg·L1时,鳞茎直系,如金黄花滇百合(张文婷等,2019)、欧洲百
-
径不升反降。以上说明,本试验条件下90mg·L1合(张旭红等,2018)、兰州百合(Yanget al.,
蔗糖最有利于京鹤不定芽鳞茎的膨大生长。2021)、毛百合(张艳波,2013)、亚洲百合(杨薇
红等,2004)、CaesarsPalace(李茂娟等,2019)、
表3 不同浓度蔗糖对京鹤不定芽鳞茎膨大的影响
-东方百合(,)、白花
处理蔗糖/g·L1鳞茎直径/cmStarfighterYoussefet 
±(Royandazagh,2019;Patilet al.,2021)等,
±
±。
±
本试验在进行百合鳞片不定芽诱导、分化时,
NAA对京鹤膨大鳞茎生根的影响在常规培养组分6-BA、NAA与蔗糖基础上,首
从表4可以看出,G2和G3处理的京鹤膨大次使用草甘膦作为诱导分化剂。结果表明,低浓度
鳞茎(组培苗)生根系数显著高于CK2和G1处理,(·L-1)草甘膦对京鹤不定芽的诱导分化效
其中G3处理的根也比其他处理更粗壮(图4)。考果显著高于常规诱导培养基,每个外植体都能分化
不定芽,,显著优于前人的试验
表4 不同浓度NAA对京鹤膨大鳞茎生根的影响结果(杨薇红等,2004;张艳波,2013;苏菁华,
处理-1生根系数
NAA/mg·L2014;Bakhshaieet al.,2016;马生军等,2018;
±
,;张文婷等,;符勇耀
± 
±,2020;Patilet al.,2021);并且,本试验中使
±-BA、NAA与30g·L-1蔗糖的常规
诱导结果,也比有些使用细胞分裂素或生长素组合
与不同浓度蔗糖的试验诱导系数高(Sahooet al.,
2018;Lestariet al.,2019;Youssefet al.,2019;
Deswiniyanti&Lestari,2020;Filippovaet al.,
2020)。
草甘膦在百合鳞片分化中的可能机制及应用
CK2G1
已有研究表明,植物体内存在一种重要的
合成芳香族氨基酸的莽草酸途径,在莽草酸途径
中,磷酸烯醇式***酸(PEP)与莽草酸-3-磷酸
(S3P)生成5-烯醇式***酸-3-磷酸莽草酸,
这步反应需要5-稀醇***莽草酸-3-磷酸酯合成
G2G3
酶(EPSPS)的催化,才能进行之后的反应并最终
图4 不同浓度NAA对京鹤膨大鳞茎生根的影响
形成苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸(Amrheinet al.,
CK2,NAA浓度为0mg·L-1;G1~、
、·L-1。1980)。草甘膦可以通过与磷酸烯醇式***酸结合
并形成5-烯醇式***酸莽草酸-3-磷酸合酶,竞
虑到组培苗后期移栽种植时,健康、粗壮的根是必争性的抑制EPSPS,阻断苯丙氨酸、酪氨酸和色氨
要的条件,·L-1NAA作为酸的合成来达到杀死杂草的效果(Jaworski,1972;
京鹤组培苗生根阶段最合适的浓度。Stephen,2019)。天然植物生长素活性成分IAA的
—60—
中国蔬菜CHINAVEGETABLES研究论文
合成分为依赖色氨酸和非依赖色氨酸两条途径,依王家利,刘冬成,郭小丽,
赖色氨酸的合成途径又分为吲哚乙醛肟途径、,47(3):292-301.
杨薇红,张延龙,童斌,杜蕙,
***酸途径、色***途径和吲哚乙酰***途径,在这些
,20(5):193-195.
依赖色氨酸的途径中,色氨酸作为合成IAA的重袁素霞,刘春,‘京鹤’.园艺学报,43
要前体物质,经过一系列酶的催化合成吲哚-3-乙(9):1845-1846.
醛肟、色***、吲哚-3-***酸等中间产物,并最终张文婷,何燕红,舒宁,邢景景,刘宝骏,包满珠,.
合成IAA,色氨酸的缺失会影响植物体内生长素的
报,54(6):773-778.
合成(王家利等,2012)。本试验中,草甘膦的加
张旭红,王頔,梁振旭,孙美玉,张金政,
入可能阻断了京鹤百合鳞片内部色氨酸的合成,,53(6):
而使生长素合成受阻,导致内源细胞分裂素和生长840-847.
素的比值升高,促进了鳞片不定芽的分化,〔硕士论
作用机制尚需进一步试验探究。文〕.哈尔滨:东北林业大学.
AmrheinN,DeusB,GehrkeP,Steinrü
草甘膦常用于转基因材料的抗性筛选,暂时未
oftheinhibitionoftheshikimatepathwaybyglyphosate:II.
发现安全问题。草甘膦是否也可以促进其他百合品interferenceterferenceofglyphosatewithchorismateformationin
种不定芽的分化有待进一步研究。,66(5):830-834.
综上,本试验建立了草甘膦诱导京鹤鳞片BakhshaieM,KhosraviS,AzadiP,BagheriH,vanTuylJM.
不定芽分化的高效方法,获得最佳诱导培养基 ,35:
1799-1826.
(MS+·L-1 6-BA+·L-1NAA+
DeswiniyantiNW,
-1-1
mg·L草甘膦+30g·L蔗糖),诱导系数达到longiflorumbulbsusingNAAandBAPplantgrowthregulator
,显著高于常规培养基;并以此为基础,,5(2):32-45.
了最佳继代增殖培养基(MS+·L-1 6-BA+,DarkhanovaVG,StroevaNS,NikolaevaOA,
--
mg·L1NAA+30g·L1蔗糖)、鳞茎膨大培养基
anddevelopmentoftherarespeciesLiliumpensylvanicumKer.-
(-1蔗糖)以及生根培养基(
MS+90g·L1/2MS+Gawl.(Liliaceae).MoscowUniversityBiologicalSciences
-1-1
·LNAA+30g·L蔗糖),建立了优良百Bulletin,75(2):71-76.
合品种京鹤的高效再生体系,为百合鳞片不定芽诱GaoSP,ZhuY,ZhouLY,FuXF,LeiT,ChenQB,YuXF,
导、组培苗生产提供了新的思路。ZhouYH,LiWJ,HuJ,HuD,
signalingfunctionontheformationandswellingofbulbletsof
,135:
〔硕士论 143-153.
文〕.雅安:,RoniMZK,
符勇耀,刘建玲,朱艺勇,徐文姬,雷美艳,,10
,(5):263-268.
47(7):1345--phosphonomethylglycine:
李茂娟,廖祯妮,邓少华,王华龙,
,35(22):Agricultural&FoodChemistry,20(6):1195-1198.
65--basedherbicidesandpublichealth:
〔硕士论文〕.北京:,35:3.
:///s10806-021-09874-z.
龙雅宜,,DeswiniyantiNW,AstariniIA,.
与环境,7(1):40-
马生军,丁万红,李淑珍,靳元元,,11(2):162-165.
,29(6):819-,AzimzadehZ,ChamaniE,
〔硕士论文〕.ofplantgrowthregulatorsandultrasoundonthebulbletproduction
武汉:
—61—
研究论文中国蔬菜CHINAVEGETABLES
Science,32(1):23-,AKeykhaF,YazdiM,
PatilAM,GunjalPP,.
,
(3):555-564.
JournalforResearchinAppliedSciencesandBiotechnology,(82)::thelastevolved
244-?.PlantPhysiology,
(4):1401-1403.
,ChaoLQ,SuXH,WangCY,DongCM,ChenSQ.
yearandacclimatizationofplantunderhot--frequencyinvitroplantletregenerationinLilium
(Csatype)-,animportantedibleandmedicinal
Napoca,47(3):734-,andconfirmationofgeneticfidelityofregenerationplantlets
SahooMR,DeviMP,DasguptaM,PrakashN,Ngachan1SV. ,15(4):
-446.
conservationofShiruilily(LiliummackliniaeSealy):alab-to-YoussefNM,ShaabanSA,GhareebZF,
VitroCellular&DevelopmentalBiology-Plant,54(6):701-orientaliscv.“Starfighter”,43:211.
:///s42269-019-0246-z.
OptimizationofHighEfficientTissueCultureRegenerationSystemfor
OrnamentalandEdibleDualPurposeLily—‘Jinghe’
QIXianyu1☆,ZHANGWenliang1,2☆,YANGPanpan1,XULeifeng1*,MINGJun1*
(1InstituteofVegetablesandFlowers,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China;2Collegeof
BiologicalScienceandTechnology,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866,Liaoning,China)
Abstract:Lilyisanimportanthigh-
efficienttissuecultureregenerationsystemwhichisthefoundationforlarge-scaleproductionandreproductionof
-inducingagenttooptimizetissue
cultureregenerationsystemtakingscaleasexplantoflilyvariety‘Jinghe’withornamentalandedibledual-
‘Jinghe’scaleadventitiousbudwasMS+
·L-16-BA+·L-1NAA+·L-1glyphosate+30g·L-1saccharose,andtheinduction
coeffici