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ChineseJournalofChromatography
技术与应用DOI:./...
1037241123202205016
超高效液相色谱⁃串联质谱法测定尿液中7种苯系物代谢物
邱天,张续,杨艳伟,胡小键,罗嵩,朱英∗
中国疾病预防控制中心环境与人群健康重点实验室
(,
中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所北京
,100021)
摘要建立了同时测定人体尿液中种苯系物代谢物的超高效液相色谱⁃串联质谱检测方法mL尿液经盐酸
:7。0􀆰5
水解EVOLUTE®EXPRESSABN固相萃取板mg净化洗脱稀释后测定使用ACQUITYUPLCHSST色
、(10)、、。3
谱柱mmmmm以%甲酸水溶液和甲醇作为流动相进行梯度洗脱分离目标化合物负离子
(100×2􀆰1,1􀆰8μ),0􀆰1,,
电喷雾多反应监测模式下测定含量种目标化合物在各自范围内线性关系良好相关系数r2方法检出
。7,()>0􀆰995;
限为马尿酸HAmg/L其余目标化合物g/L定量限为HAmg/L其余目标化合物
()0􀆰9,0􀆰02~4μ,3,0􀆰05~12
g/L在实际尿液中低中高个水平的加标回收率为%%日内精密度为%%日间精密度为
μ;、、384~123,1􀆰8~8􀆰6,
%%应用该方法测定吸烟和非吸烟人群尿液样品各份吸烟人群中种目标化合物检出率均为
1􀆰9~21􀆰4。16,7
%非吸烟人群中反⁃反式黏糠酸MU苄基巯基尿酸BMAHA和⁃***马尿酸MHA的检出率为%
100;()、()、2(2)100,
S⁃苯巯基尿酸PMA的检出率为%⁃***马尿酸MHA⁃***马尿酸MHA的检出率为%MU
()()75,3(3)+4(4)81;、
PMAMHA和MHAMHA在吸烟和非吸烟人群尿液中的浓度具有统计学差异P该方法样品用量
、23+4(<0􀆰001)。
少可进行高通量测定结果可靠适用于人体尿液中种苯系物代谢物的含量测定
,,,7。
关键词超高效液相色谱⁃串联质谱苯系物代谢物生物监测尿液
:;;;
中图分类号O文献标识码A
:658 :
Determinationofsevenmonoaromatichydrocarbonmetabolites
byultraperformanceliquidchromatography⁃
tandemmassspectrometry
QIUTianZHANGXuYANGYanweiHUXiaojianLUOSongZHUYing∗
,,,,,
ChinaCDCKeyLaboratoryofEnvironmentandPopulationHealthNationalInstituteofEnvironmental
(,
HealthChineseCenterforDiseaseControlandPreventionBeijing100021China
,,,)
AbstractMonoaromatichydrocarbonsMAHssuchasbenzenetolueneandxyleneareim⁃
:(),,
⁃
litesareincludedinhumanbiomonitoringprogramsinseveralcountriesincludingCanadathe
,,
UnitedStatesItalyandGermanybecausetheirevaluationisvitaltomonitortheexposureof
,,,
,,
MAHmetabolitesthroughultraperformanceliquidchromatography⁃tandemmassspectrometry
UPLC⁃MS/⁃
()0􀆰5
ardsolutionbeforebeinghydrolyzedbyLofmol/LHClsolutionfollowedbyextraction
40μ6,
usinga⁃wellEVOLUTE®EXPRESSABNsolid⁃
96
washedwithmLofmethanol⁃waterv/
1􀆰0(10∶90,)1􀆰0
separationwasachievedusinganACQUITYUPLCHSSTcolumnmmmmm
3(100×2􀆰1,1􀆰8μ),
收稿日期⁃⁃
∗:20220512
⁃.
∗:(010)50930161,:@()
基金项目中央财政经费项目.
:(131031108000150003)
FoundationitemProgramofCentralFinancialFundsNo..
:(131031108000150003)
色谱
·2·
withgradientelutionusing%formicacidasmobilephaseAandmethanolasmobilephaseB.
0􀆰1
Thedetectionofsevenanalyteswasperformedusingatriple⁃quadrupolemassspectrometer
equippedwithanegativeelectrosprayionizationsourceinthemultiplereactionmonitoringmode.
Thelinearrangesofthesevenanalytesvariedfromg/Ltomg/Lwithcorrela⁃
0􀆰1-20μ2􀆰5-500,
0􀆰9951􀆰5,0􀆰02,0􀆰1,900,0􀆰6,
andg/Lfortranstrans⁃muconicacidMUS⁃phenylmercapturicacidPMAS⁃
4μ,(),(),
benzylmercapturicacidBMAhippuricacidHA⁃methylhippuricacidMHAand⁃
(),(),2(2),3
methylhippuricacidMHA⁃⁃
(3)+4(4),
tificationwereandg/LforMUPMABMAHAMHAandMHA
5,0􀆰05,0􀆰4,3000,2,12μ,,,,2,3+
⁃
4,
trationlevelswithrecoveryratesrangingfrom%to%.Theintra⁃andinter⁃dayprecisions
,84123
were%%and%%%%and
1􀆰8-8􀆰61􀆰9-21􀆰4,68-99,
thematrixeffectsrangedfrom%to%.TheurinesamplesobtainedfromtheGermanex⁃
-11-87
ternalqualityassessmentschemeroundwereusedtoassesstheaccuracyofthismethod.
(65)
BothhighandlowconcentrationsofMUPMAHAandmethylhippuricacidwerewithinthe
,,,
roomtemperature℃absenceoflightwithlessthan%⁃
(20,),15
lytesinurinesampleswerefoundtobestableforatleastdat℃and℃orforsix
424-20,
freeze⁃thawcyclesanduptohinanautosampler℃.Themethodwasappliedtotheanal⁃
72(8)
ysisofnon⁃
16’16’,,,
andMHAwere%inbothnon⁃
2100’’
%non⁃smokersand%%non⁃
75’100’3+481
’’,
,2,3+4(<0􀆰001)
⁃
throughputmannerwithlargesamplesizesowingtothesmallsamplevolumeandallowedthe
,,
successfuldetectionofthesevenMAHmetabolitesinhumanurine.
Keywordsultraperformanceliquidchromatography⁃tandemmassspectrometryUPLC⁃MS/
:(
MSmonoaromatichydrocarbonmetabolitesbiomonitoringurine
);;;
苯甲苯二甲苯等苯系物被广泛用作溶剂和化工厂皮革制品厂和加油站室内装修和烟草烟雾则
、、、,
工原料常见于烟草烟雾油漆黏合剂和汽油中也是非职业暴露人群重要的暴露来源[6-8]
,、、,。
是室内空气挥发性有机物VOCs中的典型污染苯系物进入人体后经代谢主要通过尿液排出
() ,,
物[1,2]苯被国际癌症研究机构IARC归为类体外苯和甲苯的代谢主要发生在肝脏经不同代
。()Ⅰ。,
致癌物甲苯和二甲苯被归为类致癌物[3]长期谢途径分别生成反⁃反式黏糠酸MU和S⁃苯巯
,Ⅲ,()()
暴露可导致白血病或其他血液病中枢神经系统疾基尿酸PMA以及苄基巯基尿酸BMA和马尿
、(),()
病以及肝肾损伤等严重的急性暴露亦可导致死酸HA并经尿液排出其中约%甲苯转化为
,(),,80
亡[4,5]常见的职业暴露环境包括木材厂石油化HA排出体外二甲苯在进入人体后约%在肝
。、。,95
⁃
:,,,,,7,〈〉,〈〉
月PPPQQQ.
(〈〉):-
,,,,,
metabolitesbyultraperformanceliquidchromatography⁃
,〈〉,
卷月PPPQQQ.
〈〉(〈〉):-
邱天等超高效液相色谱⁃串联质谱法测定尿液中种苯系物代谢物
,:7·3·
脏中代谢为***马尿酸MHAs包括⁃***马尿DAD检测含量水平较低g/L级别的PMA
(),2,(μ)、
酸MHA⁃***马尿酸MHA和⁃***马尿BMA则通常使用HPLC⁃MS/MS进行测定虽然苯
(2)、3(3)4。
酸MHA其中%%MHAs在h内经由系物的暴露途径相似但鉴于各代谢物在人体内的
(4),70~8024,
尿液排出体外[9]苯系物暴露的常用生物标志物暴露水平差异较大鲜有方法同时测定这几种代谢
。,
包括MUPMABMAHAMHAMHAMHA物为测得尿液中PMA总量需要加入强酸进行
、、、、2、3、4。,
等其中PMA和BMA分别是苯和甲苯暴露的特水解[20]现有方法通常在测定PMA总量的同时只
。,。
异性代谢产物美国国家健康和营养检查调查[10]能测定少数几种物质[12]或在测定多种物质的同时
。、,
加拿大人健康测量调查[11]意大利生物监测[12]德测定游离状态PMA[21]本方法涉及各生物标志物
、、。
国环境调查项目[13]美国烟草与健康评估研究[14]的化合物结构信息和在普通人群中的浓度水平见表
、
及美国职业暴露人群的日常监测[15]中都涵盖了以本文建立了人体尿液中种苯系物代谢物的固
1。7
上一种或多种苯系物代谢物相萃取⁃超高效液相色谱⁃串联质谱SPE⁃UPLC⁃
。(
尿中苯系物代谢物常用的前处理方法包括液液MS/MS测定方法可在测定PMA总量的基础上
),,
萃取[15]固相萃取[11]直接稀释[16]等尿液样品用同时测定多种浓度差异较大的代谢物具有操作简
、、;,
量通常为mL[15,17,18]较大的样品体积使便所需样品量少使用溶剂量少可高通量测定等
1􀆰0~8􀆰0,、、、
得高通量测定难度较大实验效率较低检测方法优点
,。。
包括高效液相色谱⁃紫外检测器HPLC⁃UV高效
()、1 实验部分
液相色谱⁃串联质谱法HPLC⁃MS/MS高效液相
()、
色谱⁃二极管阵列检测器HPLC⁃DAD气相色谱⁃ 仪器、试剂与材料
()、
质谱法GC⁃MS等[15,17-19]其中含量水平较高AcquityIClassUPLC®超高效液相色谱仪美
()。 (
mg/L级别的HAMHAs可用HPLC⁃UVHPLC⁃国Waters公司Qtrap®三重四极杆串联质
()、、),6500+
表1 7种苯系物代谢物名称、CAS编号、结构及人群中的浓度
Table1 Names,CASnumbers,andstructuresofthesevenmonoaromatichydrocarbonmetabolites
andtheirlevelsinthepopulation
transtrans⁃MuconicacidCHO⁃⁃g/L[22]
,664358817852μ
MU
()
S⁃PhenylmercapturicacidCHNOS⁃⁃.g/gcreanon⁃smokers
1113347758080097(),
[12]
()11μ()
S⁃BenzylmercapturicacidCHNOS⁃⁃.g/L[10]
121531954277961μ
BMA
()
HippuricacidCHNO⁃⁃mg/gcrea[23]
993495692180
HA
()
⁃MethylhippuricacidCHNO⁃⁃g/L[22]
2101134201320730μ
MHA
(2)
⁃MethylhippuricacidCHNO⁃⁃g/L[10]
31011327115497194μ
MHA
(3)
⁃MethylhippuricacidCHNO⁃⁃
410**********
MHA
(4)
色谱
·4·
谱仪配电喷雾离子ESI源美国ABSciex公司前处理系统向样品中加入L混合内标溶液并
(TM)();100μ
Biotage®Extrahera全自动样品前处理系统混匀后全部转移至固相萃取板加压使样品通过固
、96,
孔EVOLUTE®EXPRESSABN固相萃取板相萃取板填料注意压力不应过大流速应小于
(10。,1
mg瑞典Biotage公司Vortex⁃Genie®涡旋混滴/s用mL甲醇⁃水v/v淋洗弃去
)();2。1􀆰0(10∶90,),
匀器美国ScientificIndustries公司APD分淋洗液后用mL甲醇洗脱收集洗脱液移取
(),250,1􀆰0,。
析天平美国OHAUS®公司L洗脱液加入L纯水混匀待测
()。200μ,600μ,,。
色谱条件
(,),(
级德国CNW®公司Mcm超纯水由色谱柱为ACQUITYUPLCHSST色谱柱
,),18􀆰2Ω· 3
IQ纯水仪美国Millipore公司制备盐酸分mmmmm美国Waters公司
7005(),((100×2􀆰1,1􀆰8μ,)。
析纯国药集团流动相A为%甲酸水溶液流动相B为%甲
,)。0􀆰1,0􀆰1
MUPMABMAMHAMHA苄基巯基尿酸⁃酸甲醇溶液梯度程序min%A%
、、、2、3、。:0~3􀆰5,95~90
dBMA⁃d马尿酸⁃dHA⁃d⁃***马尿酸⁃Amin%A%Amin
3(3)、5(5)、2;3􀆰5~8􀆰0,90~10;8􀆰0~9􀆰0,
dMHA⁃d和⁃***马尿酸⁃dMHA⁃d购于%Amin%A%A
7(27)37(37)10;9􀆰0~9􀆰1,10~95;9􀆰1~11􀆰5
加拿大TRC公司HA购于中国J&K公司反⁃反式min%A流速为mL/min柱温为℃进
;;,95。0􀆰3,40,
黏糠酸⁃dMU⁃dS⁃苯巯基尿酸⁃dPMA⁃样量为L
4(4)、()2(10μ。
质谱条件
2)。
标准溶液配制电离模式为电喷雾负离子模式ESI-检测方
(),
准确称取约mgPMABMAMHA式为多反应监测MRM模式碰撞气CAD为
1􀆰0、、2、(),()
MHAMU⁃dPMA⁃dBMA⁃dMHA⁃d和Medium气帘气CUR压力为kPa雾化气
3、4、2、3、27,()241,
MHA⁃d约mgMUHA⁃d约mgHAGS压力为kPa加热气GS压力为
37,10􀆰0、5,100􀆰0(1)345,(2)345
的标准物质用甲醇⁃水v/v溶解并定容至kPa喷雾电压IS为V离子源温度TEM
,(50∶50,),()-4000,()
mL配制成单标储备液为℃种苯系物代谢物及其对应稳定同位素
10,。550。7
分别准确移取适量各单标储备液用甲醇⁃水内标的保留时间离子对去簇电压DP和碰撞能
,、、()
v/v稀释并定容至mL配制成苯系物量CE等参数见表
(50∶50,)10,()2。
代谢物混合标准溶液和混合内标溶液于℃保
,-202 结果与讨论
存待用混合标准溶液中MU质量浓度为
,50􀆰0
mg/LPMA为mg/ 前处理条件优化
,1􀆰0,、23
为mg/LHA为mg/ 酸的选择
10􀆰0,5000;
MU⁃d质量浓度为mg/LPMA⁃d为尿液中存在一定量的PMA前体pre⁃PMA
45􀆰0,20􀆰1 (),
mg/LBMA⁃dMHA⁃d和MHA⁃d为是谷胱甘肽代谢路径上的代谢产物[24]在酸性条件
,3、27371􀆰0,
mg/LHA⁃d为mg/L下可水解生成PMA[25]尿液中pre⁃PMA占PMA
,5500。
用纯水将苯系物代谢物混合标准溶液稀释至不总量的比例因人而异研究显示在职业暴露人群和
,
同浓度并加入混合内标溶液配制标准系列工作吸烟人群中尿液中pre⁃PMA可占到PMA总量的
,,
溶液%%[25,26]前处理过程中若未经酸水解只
。75~99。,
实验条件与方法能测得游离状态的PMA只有经过酸处理才可测得
;
样品前处理方法PMA的总暴露量更能客观反映真实的暴露水平
,。
冷冻尿液在℃冰箱中过夜解冻后取出放至本实验比较了甲酸盐酸硫酸等不同种类酸及
4, 、、
室温待测充分振荡后准确移取mL待测尿其用量对尿中PMA含量测定结果的影响取
。0􀆰50。1􀆰0
液至mL孔收集板加入Lmol/L盐酸mL吸烟人群尿液样品分别加入L甲酸
296,40μ6,10~50μ、
溶液充分混匀后静置min进行水解浓盐酸或浓硫酸充分振荡水解min后进行前
,10。,、10
依次用mL甲醇和mL纯水活化和平处理和测定结果如图所示PMA测定结果出现
1􀆰01􀆰0。1,
衡孔EVOLUTE®EXPRESSABN固相萃取板平台期即酸用量大于L时PMA测定结果不
96TM,40μ,
mg使用Biotage®Extrahera全自动样品再上升说明水解反应已达到平衡其中使用甲酸
(10)。,。,
邱天等超高效液相色谱⁃串联质谱法测定尿液中种苯系物代谢物
,:7·5·
表2 7种苯系物代谢物及其稳定同位素内标的保留时间和质谱参数
Table2 RetentiontimesandMSparametersofthesevenmonoaromatichydrocarbonmetabolitesand
theirstableisotopeanalogues
AnalyteRetentiontime/minIonpairsm/zDeclusteringpotentials/VCollisionenergies/eV
()
MU.∗
47141>53,141>97,141>59-20,-20,-20-16,-12,-15
PMA.∗
77238>109,239>110-10,-20-13,-13
BMA.∗
78252>123,253>124-20,-20-17,-22
HA.∗
66178>160,178>133-20,-20-10,-20
MHA.∗
270192>91,192>148,192>174-20,-20,-20-20,-15,-10
MHA&MHA.∗
3474192>91,192>148,192>174-20,-20,-20-15,-15,-10
MU⁃d.
447145>100-10-11
PMA⁃d.
277240>109-20-27
BMA⁃d.
378255>123-20-20
HA⁃d.
566183>139-20-17
MHA⁃d.
2770199>155-65-16
MHA⁃d&MHA⁃d.
374773199>155-20-16
MHAandMHAhadidenticalparameterssamewithMHA⁃dandMHA⁃.
34,3747∗
溶液%%以%为梯度mL进行淋洗
(10~90,10)1􀆰0,
并收集淋洗液进行上机测定结果显示使用甲醇⁃
。,
水v/v淋洗时淋洗液中未检出各内标使
(10∶90,),;
用甲醇⁃水v/v淋洗时淋洗液中可检出
(20∶80,),
MU⁃d提示甲醇⁃水v/v可将样品中的
4,(20∶80,)
MU洗脱下来造成前处理净化过程中的损失因
,。
此选择甲醇⁃水v/v淋洗净化样品以完
,(10∶90,),
整保留目标化合物
。
氮吹浓缩是富集低浓度目标化合物的常用前处
理方式然而本实验发现PMA的基质抑制效应非
图1 酸种类及用量对尿中PMA含量的影响,,
Effectsofacidtypesandquantityon常严重浓缩不仅不能有效提高目标化合物的质谱
urinaryPMAcontent,
响应反而会影响方法检出限适度的稀释则是降低
,,
基质效应简单易行的方法实验比较了将mL
时测得的PMA含量低于使用盐酸或硫酸时的含。1􀆰0
量可能的原因是甲酸属于弱酸高pH环境不足以洗脱液氮气吹干后复溶于L纯水浓缩
,,100μ(10
使结合态的PMA完全水解而盐酸和硫酸属于强倍将mL洗脱液氮气吹干后复溶于mL
,)、1􀆰01􀆰0
酸低pH值足以完全水解结合态PMA但考虑到纯水不浓缩也不稀释取L洗脱液加入
,。()、200μ600
浓硫酸氧化性强为避免尿液中的其他物质氧化干L纯水稀释倍取L洗脱液加入L
,μ(4)、100μ900μ
扰目标化合物的测定最终选择使用盐酸进行酸解纯水稀释倍等不同处理方式发现与稀释
,。(10),4
实验还比较了在加入L浓盐酸或倍洗脱液相比浓缩倍与不浓缩也不稀释两种条
40μ3、5、1030,10
min后加入L%氢氧化钠溶液终止反应后进件下PMA的目标物峰面积并没有显著提高但稀
40μ50,,
行前处理和测定的结果结果显示PMA浓度没有释倍洗脱液时PMA的目标物峰面积有明显的
。,10,
因反应时间长短而发生明显变化以上种条件测降低最终确定稀释倍的处理方式可以兼顾降低
,4。4
得PMA浓度偏差小于%因浓盐酸挥发性强液基质效应和维持较低的方法检出限
5。、。
色谱条件的选择
、,
时增大移取液体的体积每L尿液加入L分别比较了mmol/L酸性甲酸铵溶液pH
(500μ40μ 5(
mol/L盐酸溶液方便实验操作提高实验精度%甲酸水溶液pH纯水mmol/L
6),,。3)、0􀆰1(2􀆰7)、、6􀆰5
样品净化条件的优化乙酸铵溶液pH作为流动相A%甲酸甲
(6􀆰5),0􀆰1
在尿液中加入内标使用固相萃取小柱对样品醇溶液纯甲醇作为流动相B的情况下各目标化
,、,
进行前处理分别使用甲醇以及不同比例的甲醇水合物的分离效果和质谱响应强度结果显示使用
。。,
色谱
·6·
%甲酸水溶液为A相时各目标化合物的响应高
0􀆰1,
于使用其他几种流动相而流动相B的种类对结果
;
影响不大最终选择%甲酸水溶液为A相甲
。0􀆰1、
醇为B相此条件下各目标化合物峰形对称峰宽
,,
窄信号强度高分离度良好见图
,,(2)。
图2 7种苯系物代谢物的总离子流色谱图
Totalionchromatogramofthesevenmonoaromatic
hydrocarbonmetabolites
比较了WatersACQUITYHSST色谱柱和图3 在使用(a)ACQUITYBEHC18和(b)ACQUITYHSS
3
T3色谱柱时HA⁃d5的选择离子色谱图
WatersACQUITYBEHC色谱柱前者的疏水性弱
18, SelectedionchromatogramsofHA⁃d5using
于后者更适宜保留