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文章编号:2095-6835(2022)12-0175-04
邻近标记技术APEX2的发展与应用
罗思,丁明
(中国药科大学生命科学与技术学院,江苏南京211198)
摘要:工程抗坏血酸过氧化物酶(TheEngineeredAscorbatePeroxidase,APEX2)是一种能够有效地
应用于研究活细胞内蛋白质与蛋白质的相互作用的方法。与其他传统的蛋白质互作研究方法相比,
APEX2技术不仅可以允许靶向和邻近依赖性标记蛋白质,并且实现了亚细胞室的蛋白质组学定位以及
动态蛋白质复合物的识别,现已成为蛋白质组学分析的一种新方法。主要总结了APEX2的技术发展及
其在不同类型的蛋白质组的应用。
关键词:APEX;APEX2;生物素化;蛋白质相互作用
中图分类号:Q816文献标志码:ADOI:.
研究活细胞细胞器和亚细胞区域的蛋白质组有助究的问题,例如亚细胞器中蛋白质的定位与分析、某
于理解细胞中组织和蛋白质相互作用网络,因此兴起些存在争论的蛋白质的结构以及动态蛋白质复合物的
了许多方法。基于邻近标记的方法结合质谱(MS)的识别与鉴定等。本文主要对APXE2技术进行总结与归
蛋白质组的系统分析为研究蛋白质的相互作用提供了纳,阐述其作用原理及APXE2技术在不同类型的相互
一种高通量的方法。近年来,研究蛋白质相互作用的作用的蛋白质组的应用。
邻近依赖标记技术也取得了很大发展。目前用于邻近1APEX2技术的策略
标记技术的酶主要有3种:辣根过氧化物酶(HRP)、(APXE2)
邻近依赖的生物素鉴定(BioID)和工程抗坏血酸过氧抗坏血酸过氧化物酶(APX)是一种I类胞质植
化物酶(APEX)。虽然第一个基于生物素邻近标记的物过氧化物酶,与HRP不同,由于缺乏二硫键和钙离
研究是利用HRP和芳基叠氮生物素做底物进行的[1],子,所以能够在还原环境中保持天然的活性[8]。野生型
但是HRP在哺乳动物细胞质中并不活跃。在细胞质的的APX并未在哺乳动物细胞中进行测试,并且其天然
还原环境中,HRP的4个二硫键和2个Ca2+离子结合底物抗坏血酸盐的结构与二氨基联苯***(DAB)基本
位点会被破坏,不能稳定维持自身结构[2]。这一缺陷限不相同,加上APE是同型二聚体,严重影响蛋白质的
制了其在细胞内相互作用方面的使用,因此HRP逐渐天然定位和功能[9-10],导致APE的适用性不大。随后
退出蛋白质相互作用研究的舞台。基于BioID的邻近MARTELL等[11]在APE基础上进行改造,最终得到一
标记采用了来自大肠杆菌的生物素连接酶BirA的突变种名为APEX的单体抗坏血酸过氧化物酶;相对于
形式,利用质谱检测BirA修饰生物素化蛋白,可以鉴APE而言,APEX不仅缺乏二硫键和钙结合位点,可
定出与感兴趣蛋白相互作用的微弱或者短暂的蛋白以在还原性的胞质环境中表达而不失去活性,并且其
质,目前这种技术已成功用于天然环境中相互作用伙活性得到很大改善。经过改造过后的APEX,可以用
伴的生化筛选[3-5]。然而在BirA标记过程中,BirA的于电子显微镜(EM)的细胞内特异性蛋白质成像[11]
产物——生物素-腺苷酸酯的半衰期长达数分钟,以至和空间分辨蛋白质组学定位成像[6-7]。然而APEX在使
于它导致的标记半径偏大,得到的结果假阳性偏多。用过程中有一个很大缺陷——低灵敏度。当APEX表
此外BirA标记的速度很慢,通常需要18~24h,因此达量低时,其功能受到很大的局限性。因此LAM等[12]
很难研究高度动态的蛋白质相互作用。因此BioID技通过酵母展示和定向进化技术,在APXE的基础上进
术不能很好地运用于亚细胞结构中蛋白质相互作用,行随机突变,最终得到一种A134P的突变体,并命名
为了提高空间和时间的特异性,APEX2技术则被开发为APEX2。它相对于APEX而言,具有相同的化学性
出来[6-7]。随着APEX2技术的不断拓展,越来越多的质,但是其催化活性和表达量得到很大改善。由于
科学家开始利用APEX2技术来解决一些以前难以研APEX2标记过程产生的生物素-苯氧基自由基是短寿
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科技与创新┃ScienceandTechnology&Innovation2022年第12期
命的(<1ms),能够产生一个较小的标记半径(<20nm),通过电子显微镜证实。RHEE等的研究充分展示了
因此APEX2标记能够提供更高的空间和时间特异性。APXE技术在面对基质的内膜蛋白和膜间空间(IMS)
为了解决对依赖于相互作用的邻近标记工具的需求,之间具有特别的特异性和区别。APEX介导的蛋白质
HAN等[13]也在APEX2的基础上,对其进一步定向进组映射的特异性,结合其易用性,为生物学家了解活
化改造,得到了一种叫做分裂的APEX(sAPEX),sAPEX细胞的分子组成提供了一个强有力的工具。
技术扩展了邻近标记的方法,具有更高的时空分辨率,随后HUNG等[7]通过对线粒体IMS的研究,进一
将基于APEX方法的效用扩展到生物学的新领域。步证实APEX技术能够实现空间和时间特异性蛋白质
。此外APEX2也已经成功地应用于线粒体外
APEX2技术原理可以分为两大方向:①APEX2膜和内质网外膜[14]和自噬体内腔[15]中蛋白质组的研
能够在细胞内形成电子密度高的锇,然后通过EM进究。APEX2技术除了应用于这几个膜细胞器的研究外,
行结构的判断。活细胞可以在二氨基联苯***(DAB)有科学家将APEX2技术也成功应用于细胞核中蛋白
[16]
和双氧水(H2O2)的溶液中固定,APEX2可以催化质组学的研究。核层(NL)是位于内部核膜下的细
DAB的聚合和局部沉积,随后吸收电子密度较高的锇,胞核的一个亚结构。NL的主要结构成分是中间丝蛋
最后形成对比,最后用EM可视化APEX2的表达结白,分为A型和B型。TRAN等[17]通过将APEX2融
构[11]。②APEX2能够在通过生物素化邻近蛋白质,从合到NL-B1蛋白中,成功地识别出NL近端蛋白、RNA、
而进行蛋白质组学的分析。APEX2酶能够在H2O2的DNA。APEX的应用并不局限于膜封闭的细胞器的分
存在下,将生物素-苯酚(BP)氧化成极短寿命(<1ms)析,它已成功地用于分析非膜封闭的细胞器的蛋白质
和高度活性的自由基,然后它们可以共价连接到在邻组,如原发性纤毛[18]。
近的内源性蛋白质中的富含电子的侧链氨基酸残基除了成功利用APEX技术来分析细胞器蛋白质组
[6,11]
上,从而对底物进行生物素标记。通过去除H2O2学分析外,APEX还为鉴定相互作用的蛋白质提供了
和加上淬灭缓冲液,可以中止标记反应,然后可以利一个很好的工具。例如将APEX2与内质网上的Ca2+
用链霉亲和素的珠子分离得到生物素化蛋白,并通过传感器STIM1融合,在活细胞中能够很好地映射内质
质谱进一步分析[6-7]。网和细胞膜连接的蛋白质组,也鉴定出STIM激活的
2APEX2技术的应用增强子TMEM110(STIMATE)[19]。BERSUKER等[20]
,
细胞器蛋白质组和亚细胞结构域的表征对于理解这种方法不仅鉴定到许多之前验证过的脂滴蛋白,也
细胞组织、识别蛋白质复合物以及蛋白质相互作用网揭示了新的脂滴蛋白,并且还能通过APEX2技术对脂
络是必不可少的。APEX2技术介导的邻近标记最早是滴动态蛋白质组学进行研究,揭示其调控机制。KE
由RHEE及其同事发现,其目的是规避传统的线粒体等[21]也是在APEX2的基础上,通过对修饰的酚羟基结
纯化的局限性和实现细胞器蛋白质组定位的时空特异构进行设计,得到了高标记特异性的生物素-苯酚类似
性[6]。由于生物素-苯氧基自由基不具有膜透性,APEX2物,也同样展示出APEX2技术能够很好地应用于在活
技术非常适合用于膜封闭的亚细胞室的蛋白质组学分细胞内相互作用蛋白质的分析。
析,例如线粒体基质、内质网、自噬体等结构。
体由外膜(OMM)、内膜(IMM)以及线粒体基质组除鉴定相互作用蛋白外,APEX2技术同样具备强
成。线粒体基质是IMM所包围的内部的亚细胞器区大的定位功能。Sigma-1受体(S1R)主要定位于内质
域,位于OMM和IMM之间的区域称为膜间空间网(ER),作为一个多能的细胞内信号分子,在细胞中
(IMS)。为了检测APEX在蛋白质组学上的标记能力,有多种作用,包括离子通道调节、应激信号和转录调
RHEE等将线粒体基质靶向APEX用于人胚肾细胞节,然而,这种蛋白质在细胞内的基本拓扑结构仍然
(HEK),并结合双态SILAC标记和MS进行相对定存在争议。由于关于ER膜中S1R蛋白确切拓扑结构
量,最终495个蛋白被鉴定为线粒体基质蛋白,其中的报道相互矛盾,MAVYLUTOV等[22]应用APEX2技
94%的蛋白质有线粒体注释,另外6%被认为是新的线术,在全长S1R蛋白的N端或者C端连上APXE2,
粒体蛋白。此外一些先前被认为存在于IMS或OMM再利用APEX2技术能够在细胞内形成电子密度高的
的蛋白质,包括原卟啉原氧化酶,被APEX技术得到锇,然后通过EM进行结构判断的原理,最终确定了
的蛋白质组数据重新分配到线粒体基质的归属,并且全长S1R的N端面对细胞质,而C端面对内质网腔,
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成功地解决了Sigma-1受体N端和C端的拓扑结构的3总结
问题,展示出APXE2技术在争论的蛋白质的结构上的作为一种邻近标记技术,APEX2技术不仅可以实
强大定位功能。现蛋白质相互作用的鉴定,也实现了亚细胞结构中蛋
、动态的蛋白质复合物的识别,
APEX2不仅可以研究蛋白质的相互作用,还可以使得APEX2技术被越来越多的人所接受。APEX2技
应用于分析细胞内RNAs的空间环境和RNA蛋白相互术能追踪细胞内瞬时的、动态的分子间相互作用,更
作用。不同的核糖核蛋白复合物控制mRNA的加工、好地绘制分子间相互作用图谱,获得更为深入全面的
翻译和衰变。这些复合物中的转录本定位于细胞的特生物学信息。相信在不久的将来,APEX2技术能够成
定区域,并可以凝结成非膜结合结构,如应激颗粒。为研究生命科学问题主流手段。
然而,事实证明,绘制这些大型动态结构的RNA组成参考文献:
具有挑战性。2019年,PADRÓN等[23]利用APEX2技[1]KOTANIN,GUJG,ISAJIT,
术,开发了一种名为APEX-seq的技术,解决了RNAsvisualizationofcellsurfacemolecularclusteringin
的定位问题,并且还鉴定出关键的RNAs结合蛋白。livingcells[J].Proceedingsofthenationalacademy
将空间转录组(如APEX-seq所揭示的)与空间蛋白质ofsciences,2008,105(21):7405-7409.
组(如APEX-质谱所确定的)进行匹配,精确地平行[2]HOPKINSC,GIBSONA,STINCHCOMBEJ,
获得,
构和应激颗粒组成提供了新的见解。APEX2技术允许peroxidaseasreporterenzymeforprotein
一个强大的和通用的方法来探索大分子的空间环境。localizationintheelectronmicroscope
2020年,HAN等[24]也利用MS2-MCP系统和设计的[J].Methodsinenzymology,2000,327:35-45.
CRISPR-Cas13系统将APEX2以高特异性靶向人端粒[3]ROUXKJ,KIMDI,RAIDAM,
酶RNAhTR,在1min的邻近生物素化过程中,捕获biotinligasefusionproteinidentifiesproximaland
了hTR的候选结合伙伴,发现了12未鉴定过的hTRinteractingproteinsinmammaliancells[J].Journalof
结合蛋白。MS2-和Cas13靶向的APEX2技术有助于cellbiology,2012,196(6):801-810.
发现活细胞中新的RNA蛋白相互作用。[4]KIMDIN,BIRENDRAKC,ZHUWH,et
除了细胞水平外,APEX2技术也同样适用于体内proximity-dependentbiotinylation[J].Proceedings
研究。CHEN等[25]通过构建mito-APEX,成功地将ofthenationalacademyofsciences,2014,111:
APEX2技术用于表征活果蝇肌肉细胞中的线粒体基质2453-2461.
蛋白质组,实现了APEX2在体内的研究。利用APEX2[5]FIRAT-KARALAREN,RAUNIYARN,YATESJ
技术建立了活果蝇组织的蛋白质组定位平台,一旦激R,
活,APEX2酶催化邻近内源性蛋白质的生物素化,然componentsidentifyregulatorsofcentriole
后可以被分离并被质谱鉴定。APEX2技术在果蝇不同duplication[J].Currentbiology,2014,24:664-670.
亚细胞室的多个组织中具有有效的标记功能,并绘制[6]RHEEHW,ZOUP,UDESHIND,
了果蝇肌肉线粒体基质蛋白质组图,进一步证明mappingofmitochondriainlivingcellsviaspatially
APEX2技术在活细胞亚细胞蛋白质组表征方面的能力。restrictedenzymatictagging[J].Science,2013,
此外APEX2也已被进一步应用于酵母细胞,利用339:1328-1331.
优化过的APEX2技术,HWANG等[26]在酵母细胞中鉴[7]HUNGV,ZOUP,RHEEHW,
定出一个新的高尔基定位的蛋白酶Rbd2的结合蛋白mappingofthehumanmitochondrial
——Cdc48,并表明该蛋白在Rbd2识别SREBP中的intermembranespaceinlivecellsviaratiometric
发挥作用。SINGER-KRÜGER等[27]也在酵母细胞中,APEXtagging[J].Molecularcell,2014,55:332-341.
通过APEX2技术结合细胞培养中氨基酸的稳定同位[8]PATTERSONWR,
素标记(SILAC),很好地展示膜封闭和半开放室、线ofrecombinantpeacytosolicascorbateperoxidase
粒体基质和细胞核的蛋白质组图谱,并发现了一个全[J].Biochemistry,1995,34(13):4331-4341.
新的蛋白Yer156C。[9]MANDELMAND,SCHWARZFP,LIH,
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科技与创新┃ScienceandTechnology&Innovation2022年第12期
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