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李金泽,郑欣宁,杨芳芳,郑思涵
2015年11月9日
一、何为伤寒
伤寒是由伤寒杆菌引起的急性肠道传染病。伤寒是一种古老的传染病,但在目前的传染病防治中,仍占有重要的地位。我国的中医学书刊中所称的“伤寒”,指许多热性疾病,在中医学属于“湿温”病范畴,与现代医学的伤寒与副伤寒,具有不同的含义。伤寒是一种全身性的疾病,并非只局限于肠道受损。伤寒的基本病理特征是持续的菌血症与毒血症,单核吞噬细胞系统的增生性反应,以回肠下段淋巴组织为主的增生、肿胀、坏死与溃疡形成等病变为显著。
二、伤寒的检测
伤寒是由伤寒杆菌引起的急性传染病,终年可发病,以夏秋季为多。对沙门菌进行快速检测,及早发现传染源,切断传播途径,是最有效地防治沙门菌病的手段。
一直以来,伤寒的实验室诊断方法主要靠细菌培养和肥达氏反应。前者的阳性率受病人应用抗生素的影响,而后者在病程的后期才出现阳性,且敏感性较低。这两种检测方法繁琐,需要时间较长,难以达到早期、快速诊断目的。为寻求敏感而特异的伤寒杆菌抗体检测法,我们建立了ELISA试验,检测伤寒病人血清中O抗体,我们采用购买的的伤寒沙门氏菌O抗原免疫家兔,抽取家兔血,经分离与粗纯化,得到粗纯化的伤寒沙门菌O抗体,建立检测伤寒沙门氏菌O抗体的ELISA竞争法,并对伤寒沙门氏菌O抗体进行了检测。
竞争法
竞争法(ComperingELISA)可用于测定抗原,也可用于测定抗体。以测定抗原为例,受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合,因此结合于因相的酶标抗原量与受检抗原的量成反比。操作步骤如下:①将特异性抗体与固相载体联结形成固相抗体,洗涤、封板;②待测管中加受枪标本与一定量酶标抗原的混合溶液,使之与因相抗体反应。如受检标本中无抗原,则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。这样,受捡标本中抗原量越高,则由于这些抗原与固相抗体的结合,竞争性的占去了晦标抗原与固相抗体结合的机会,使酶标抗原与固相抗体的结合量越少。参考管中只加酶标抗原。孵育后,酶体抗原与固相抗体的结合可达最充分的量、洗涤。③加庇物显色。参考管中由于结合的酶标抗原量最多,故颜色最深。。。
二、抗体的鉴定
直接凝集试验
,37℃,2500r/min离心30min,取血清。
取洁净试管10支,编号,将血清做1:10稀释。
混匀后,37℃孵育2~4小时,观察结果。
管号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
生理盐水
稀释血清
0
伤寒菌液
终稀释浓度
1:20
1:40
1:80
1:160
1:320
1:640
1:1280
1:2560
1:5120
—
弃
四、酶标抗体的制备——过碘酸钠法
①-NaAc缓冲液中,,混匀,4℃作用30min。
②%,室温放置30min。
③~,,4℃过夜。
④,混匀,4℃作用2h,,4℃过夜。
⑤次日收集。
五、ELISA预实验
①包被抗原:伤寒抗原用包被液稀释,,37℃作用4h(或4℃作用24h)。
②洗涤:弃去孔中液体,洗涤液洗涤3次,每次30s,于吸水纸上充分拍干。
③加入样品:,混匀,放入37℃恒温箱中孵育30min。
④洗涤:弃去孔中液体,洗涤液洗涤3次,每次30s,于吸水纸上充分拍干。
加入底物液:每孔加入底物液A液1滴,B液1滴,避光放置5~15min,观察颜色变化。
1:1
1:5
1:25
1:125
1:25
1:50
1:100
1:200
待测
Ab
酶标
Ab
ELISA预实验
六、ELISA正式实验
①包被抗原。
②弃去ELISA板孔中的包被液,用洗涤液洗涤3次,每次30s,在滤纸上拍干。
③将各组原倍的待测血清与工作浓度的酶标抗体,分别加入各孔中,,同时设定阴性对照,37℃孵育30min。
④弃去孔中液体,用洗涤液洗涤3次,每次30s,在滤纸上拍干。
⑤加底物显色,每孔加入底物液A液1滴,B液1滴,避光放置5~15min,观察颜色变化。