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[摘要]目的:观察姜黄素对实验性动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)家兔血浆一氧化氮(NO)水平,结构型一氧化氮合酶(constitutiveNOS,cNOS)活性和非对称性二***精氨酸(asymmetricdimethylarginine,ADMA)的影响,探讨姜黄素抗AS作用及与ADMA的相关性。方法:38只雄性日本大耳白兔随机分为4组,即对照组(8只,喂食普通饲料)、模型组(10只,喂食高脂饲料)、低剂量姜黄素组(10只,喂食高脂饲料+100mg·kg-1·d-1姜黄素)和高剂量姜黄素组(10只,喂食高脂饲料+200mg·kg-1·d-1姜黄素)。于实验的第12周末测定血浆TC,LDL-C,NO,内皮素(endothelin,ET),ADMA水平,主动脉组织cNOS活力,同时留取主动脉组织行病理检查。结果:喂食高脂饲料的3组较对照组家兔血浆ADMA和ET水平浓度均有升高(P<),血浆NO浓度、动脉组织cNOS活性降低(P<)。姜黄素组家兔血浆ADMA和ET水平较模型组低(P<),血浆NO浓度、动脉组织cNOS活性则要高出于模型组(P<),2个姜黄素组之间未见显著性差异。结论:姜黄素有可能通过降低血浆ADMA水平,在AS进程中发挥重要的内皮保护作用。
[关键词]动脉硬化;非对称性二***精氨酸;姜黄素;一氧化氮;一氧化氮合酶
冠心病属祖国医学“胸痹”范畴。早在汉代张仲景就把其病因病机归纳为“阳微阴弦”,即上焦阳气不足,下焦阴寒气盛,认为乃本虚标实之证。标实当泻,尤重活血通脉,宣痹通阳治法;本虚宜补,尤其重视补益心血之不足。而内皮功能不全是动脉粥样硬化(AS)发生发展的一个重要始动因子[1],一氧化氮(NO)、内皮素(ET)等活性物质平衡失调、内皮依赖性舒张功能受损被认为是这一过程的始动因素和中心环节。ADMA由含***化精氨酸残基的蛋白质在蛋白精氨酸N-***转移酶(PRMT)的催化作用下水解生成,能竞争性抑制NOS,使NO合成减少、活性降低,进而导致血管内皮功能障碍,是一种血管内皮功能失调的危险因子。
姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄根茎中提取的一种酸性酚类物质。研究表明,姜黄素具有抗内皮功能失调、抗氧化等作用[2-3],可能在多个环节上影响AS的发生和发展[4],但目前尚未明确姜黄素在AS过程中对ADMA的影响及其可能的作用机制。本研究旨在基于以上的理论与研究进展,通过建立家兔AS模型,应用不同浓度的姜黄素进行体内干预,观察姜黄素对其保护作用,并初步探讨其作用是否通过影响ADMA的产生来实现。
1材料与方法
~3月龄健康雄性日本大耳白家兔,~,由温州医学院动物实验中心提供,浙医动字2200300002,在实验中心饲养。采用高脂饲料即89%基础饲料、10%猪油、1%胆固醇复制AS动物模型。胆固醇由上海国光生物有限公司生产;姜黄素由神威药业有限公司生产,纯度>99%;NO试剂盒,NOS试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。ADMA标准品,邻苯二甲醛衍生试剂(OPA),3-巯基丙酸购于Sigma公司,高效液相色谱仪为Agilent1100系列。鼠抗兔巨噬细胞单克隆抗体(克隆号RAM11)购于LABVISION公司。山羊抗兔二抗,BAD染色试剂盒购于上海基因公司。姜黄素为黄色粉末,%羧***纤维素纳(CMC-Na)溶液配成10g·mL-1的混悬液(现配现用),供家兔灌胃用。
,随机分为4组:正常对照组(8只)、模型组(10只)、姜黄素低、高剂量组(各10只)。对照组予喂饲正常饲料,模型组和姜黄素组给予高脂饲料喂养,每只家兔每日进食量均为150g,单笼喂养,饮水不限,连续喂养12周。在喂养过程中,%CMC-Na10mL·kg-1体重灌胃,低、高剂量姜黄素组分别给予10,20g·L-%CMC-Na姜黄素混悬液按10mL·kg-1体重灌胃(即给予每千克体重100,200mg姜黄素灌胃)。每日1次。
,禁食12h,经耳中央动脉取血备用。20%乌拉坦20mL·kg-1腹腔注射,沿腹正中线切开,将主动脉从心脏与主动脉连接的位置及髂动脉分支处剪断,离体后纵向剪开主动脉,剥离动脉外膜,生理盐水冲洗后于胸主动脉起始端剪取1cm血管制作组织匀浆,剩余标本予10%中***尔马林溶液固定,待苏丹IV染色及病理检查。
,标本经3000r·min-1离心15min,取血浆,用全自动生化仪检测血脂指标。TC测定用CHOD-PAP法;LDL-C测定用直接法;采用***还原酶法测定血浆NO含量,步骤严格按照说明书操作进行。
,冰生理盐水冲洗2次后,匀浆器制作10%的组织匀浆,2000r·min-1离心10min,取上清液,按试剂盒说明书严格操作。
,,,,,,·L-1的ADMA标准品溶液系列,经高效液相色谱分析制作标准曲线。取分装冷冻的血浆1mL,加5-磺基水杨酸去蛋白,离心取上清,经预先配置的OPA衍生试剂衍生后,进样,测定血浆ADMA含量。%中***尔马林溶液固定12h后的主动脉,水冲10min,擦干后放入苏丹IV染液8min,斑块部位着色,多媒体彩色病理图文分析系统IMAGINEPRO分别测量斑块面积和主动脉内膜面积,计算斑块面积占内膜面积的百分比。
,石蜡包埋,制作厚5μm切片。①HE染色:苏木素、伊红套染,常规脱水,树脂封片。②免疫组化:每个标本取3张切片,PBS洗3次,每次5min,然后用3%的H2O2泡20min,PBS洗3次,加一抗,4℃过夜,PBS洗3次,加酶标二抗,37℃作用30min,PBS洗3次,加BAD镜下观察显色约1min,观察结果。苏木素套染,常规脱水,树脂封片。棕黄色颗粒状产物为阳性标记。
,实验数据计量资料以±s表示,进行方差齐性F检验,组间比较显著性分析用LSD-t检验。P<。
2结果
,血生化检测示对照组家兔血TC,LDL-C分别为(±),(±)mmol·L-1,而模型组家兔检测结果示血TC,LDL-C分别为(±),(±)mmol·L-1,较对照组已经有了明显的升高(P<)。至第12周末,高脂饲料饲养的家兔体重可见明显加重,复查血浆TC,LDL-C分别为(±),(±)mmol·L-1。动脉内膜见大量乳白色脂质斑块产生,内膜有明显隆起,动脉弹性显著下降。主动脉苏丹IV染色测斑块面积,模型组斑块面积占主动脉内膜面积的(±)%(图1)。组织HE染色可见内膜增厚,斑块形成,增厚的内膜中含大量泡沫细胞,内膜表面不光滑,内皮细胞缺失或不连续,中膜不规则增厚,平滑肌纤维显著紊乱。,模型组和2个姜黄素药物干预组较对照组血浆TC和LDL-C均有升高(P<)(表1),其中第12周末模型组血浆TC和LDL-C较对照组分别升高约36,34倍,而2个姜黄素药物组血浆TC及LDL-C的水平较可见明显要低于模型组(P<),其中,相对于模型组的(±)mmol·L-1,LDL-C在高、低剂量姜黄素组分别为(±),(±)mmol·L-1。但在2个药物组之间,TC和LDL-C的浓度未见显著性差异。
表1第6周末和第12周末家兔体重、血浆总胆固醇和低密度脂蛋白浓度变化(±s)
Table1Thechangesofweight,serumTC,LDL-Cafter6and12weekstreatment(±s)
,NO,血管组织cNOS活力影响模型组血浆NO、组织cNOS活力较对照组均显著降低(P<),分别只有(±)μmol·L-1和(±)nmol·g-1·min-1,未及对照组的1/3和1/4;ET则升高2倍多,为(±)ng·L-1。而高、低剂量姜黄素组与模型组相比,血ET表现为下降(P<),而血浆NO含量和组织cNOS活力均有显著的提高(P<)。2个药物组间各指标未见显著差异(表2)。
,以峰面积为纵坐标,ADMA浓度为横坐标进行线性回归,得直线回归方程Y=+,R2=。梯度洗脱成功分离血浆标本各峰(图2)。第12周末,模型组较对照组血浆ADMA水平明显升高(P<),而同时发现,虽然2个药物组家兔血ADMA浓度尚无统计学意义,但它们都要显著低于模型组(P<)(表2)。
,脂质斑块显示为明显区别于周围组织的红色,经IMAGINEPRO测量,对照组主动脉壁无粥样硬化斑块形成,模型组斑块面积占主动脉内膜总面积的(±)%,高、低剂量姜黄素组斑块所占内膜面积比率分别为(±)%,(±)%,2个药物组同模型组比较,差异均有统计学意义(P<),但2个药物组间未见显著性差异。
(RAM-11)表达;模型组和姜黄素组动脉粥样硬化斑块中RAM-11有不同程度的表达,2个姜黄素组斑块区RAM-11的表达弱于模型组(图3,表3)。平滑肌细胞(1A4)在对照组仅在动脉中膜见表达;模型组和姜黄素组动脉中膜和动脉粥样硬化斑块纤维帽中均见1A4表达,其中2个姜黄素组斑块区1A4的表达强度及阳性区域均小于模型组。模型组斑块区还可看见典型的平滑肌细胞迁移,2个姜黄素组平滑肌增殖和迁移均弱于前者(图4,表3)。
3讨论
姜黄素在心血管系统中具有调节血脂、抗脂质过氧化、抑制血栓形成、血小板聚集、增加心肌缺血预适应能力等作用。虽然姜黄素的药理作用广泛,但探讨姜黄素抗AS机制方面的研究却十分有限。
ADMA作为一种NOS抑制剂,广泛存在于组织和细胞中,它能通过抑制NO的产生,影响血管内皮功能。ADMA浓度提高所致内皮功能不全将启动并加快动脉粥样硬化的进程[5],增加动脉硬化事件。近年国内外研究[6]同样证实,在动脉粥样硬化患者和具有动脉粥样硬化高危因素的患者血浆中ADMA的浓度明显增加,并且与内皮功能不全和动脉粥样硬化程度具有明显的相关性,是冠心病的一个独立危险因子[7],甚至有可能指导今后的治疗策略,故必将具有更加突出的研究利用价值。本实验以姜黄素干预家兔动脉硬化过程,观察其抗AS作用,并试图以ADMA为切入点,通过ADMA来解释姜黄素抗AS的可能机制。目前已证实血管内皮依赖性舒张功能障碍是AS病变早期最为突出的病理生理改变,并持续存在于病变的整个过程,NO和ET是早期判断血管内皮细胞功能改变的指标之一。本研究在观察姜黄素对动脉粥样硬化家兔模型影响的过程中,发现姜黄素有着显著的抗动脉硬化作用。姜黄素组的血脂水平、动脉内膜斑块形成、巨噬细胞和平滑肌细胞的表达均显著低于模型组。除此之外,相对于对照组,模型组血浆NO水平显著降低,血浆ET水平明显升高,提示AS家兔ET/NO的平衡失调,内皮功能紊乱;而相对于模型组来说,姜黄素组血浆NO水平要高于模型组,ET水平则有下降,但2个浓度姜黄素药物组之间未见差异。可见姜黄素对提高血浆NO浓度和降低ET都有显著的作用,提示姜黄素对AS发展过程中ET/NO的平衡失调有调节作用,具有作为抗心血管疾病药物的潜能。
本研究结果还显示模型组家兔血浆ADMA浓度要明显高于对照组,且高脂饲料喂养家兔6周,已出现血浆ADMA水平上升,提示ADMA升高并非是动脉粥样硬化的伴随现象,而是动脉粥样硬化的致病因素。本研究发现,姜黄素组cNOS活力要高于模型组,之前有研究推测姜黄素通过抗自由基,调节脂质代谢,减少NO的降解和抑制其合成。本实验观察到姜黄素组家兔在动脉硬化有显著减轻之外,血浆ADMA含量亦有明显的下降,故进一步推测姜黄素亦有可能通过干扰ADMA的生成和代谢,进而促进NO合成、释放以及释放后的作用等机制,从而达到保护内皮功能,达到抑制内膜增生和抗动脉粥样硬化病变进展的作用。而本实验免疫组化结果显示姜黄素药物组动脉硬化粥样斑块中巨噬细胞和平滑肌细胞表达均弱于模型组,也验证了姜黄素的抗动脉粥样硬化作用。这些结果无疑又为进一步解释姜黄素的抗AS机制提供了一条重要的线索。另外从实验结果来看,在2个姜黄素组之间未见显著性差异,认为此2个剂量抑制动脉粥样硬化的效果未见差别。但至于姜黄素通过何种方式干扰体内ADMA的生产代谢,仍需要更加进一步的研究论证。目前已知氧化应激能损害ADMA的水解酶——二***精氨酸二甲***水解酶的活性,而姜黄素具有抗氧化的药理作用,推测这可能是其之所以能降低血浆ADMA浓度的机制之一。
综上所述,提示姜黄素能通过调节血浆ADMA水平,影响cNOS活力和ET/NO的平衡,缓解动脉内皮舒张功能的损害和血管内膜增生,达到对抗AS的形成作用,其在动脉粥样硬化的防治中的应用具有较为广阔的前景。
[参考文献]
[1]ToggweilerS,[J].ClinCardiol,2010,33(12):746.
[2]RungseesantivanonS,-inducedendothelialdysfunctionassociatedwithdecreasedvascularsuperoxideproductionandPKCinhibition[J].BMCComplementAlternMed,2010,10:57.