声动力治疗巨噬细胞通过促进ATP释放趋化单核细胞科研训练精品.doc

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分类号: 172033
172075
哈尔滨医科大学
七年制学生基本阶段
科研训练论文
题目:声动力治疗巨噬细胞通过增进ATP释放趋化单核细胞
学科、专业:病理生理学教研室
学生姓名:曹博然张翰赵雪竹
指导教师:田野专家
指引研究生:孙鑫郭淑媛陈海波
二○一二年七月
目录
目录 1
中文摘要 2
Abstract 3
文献综述 5
前言 12
材料与措施 13
技术路线 15
结果 16
讨论 19
结论 21
致谢 21
参照文献 22
中文摘要
目的:证明声动力治疗(sonodynamictherapy,SDT)巨噬细胞可以趋化单核细胞的汇集并探讨其机制。
方法:将实验对象分为对照组、SDT组、ATPase组及SDT-ATPase组。其中对照组为单纯THP-1源性巨噬细胞,而SDT组是在对照组基本上加入终浓度为15μg/ml的5-氨基***戊酸(5-Aminolevulinicacid,ALA),孵育2小时后接受声动力治疗。ATPase组及SDT-ATPase组则是分别在对照组和SDT组基本上加入ATPase。将实验对象离心后取其细胞上清液并分别用transwell措施研究其对单核细胞的趋化作用;将实验对象分为对照组、SDT组、zVAD-fmk组及SDT-zVAD组。其中对照组为单纯THP-1源性巨噬细胞,SDT组是在对照组基本上加入ALA,孵育2小时后接受声动力治疗。zVAD-fmk组及SDT-zVAD组则是分别在对照组和SDT组基本上加入N-苯***氧化碳酰-缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-***化***(zVAD-fmk)。将实验对象离心后,分别用荧光素酶措施检测细胞上清及细胞内ATP量的变化。
结果:用transwell措施研究声动力治疗后的细胞上清对单核细胞的趋化作用时,从募集的单核细胞数量来看,声动力治疗组明显高于对照组(p<),加入ATPase并进行声动力治疗组与声动力治疗组相比明显减少,对照组与ATPase组无记录学差别(p>);用荧光素酶措施,检测声动力治疗巨噬细胞后及加入凋亡克制剂后细胞上清及细胞内ATP量的变化得出:声动力治疗组明显高于对照组,约为其3倍(p<);加入zVAD-fmk并进行声动力治疗组较声动力组明显减少;对照组与zVAD-fmk无记录学差别(p>)。
结论:声动力治疗巨噬细胞通过增进凋亡有关的ATP释放趋化单核细胞
核心词:ATP动脉粥样硬化声动力疗法巨噬细胞
Abstract
Purpose:Thispaperisdesignedtoinvestigatetheeffectsofmonocytesrecruitmentaftersonodynamictherapyanddelveintoitsmechanism.
Methods:Thesubjectsweredividedintofourgroups:Thecontrolgroup,theSDTgroup,theATPasegroupandtheSDT--,containingmacrophagesandsonosensitizerALA,,theSDT-ATPasegroup,-freesupernatantsfromeachgroupwereassessedfortheirabilitytoattractTHP-,weuseanotherfourgroupsofsubjects:Thecontrolgroup(macrophagesalone),theSDTgroup,thezVAD-fmkgroup(addedcaspase-inhibitorzAVD-fmk)andtheSDT-zAVDgroup(liketheSDTgrouppretreatedwithzAVD-fmk).Supernatantsandcelldebrisafterhighspeedcentrifugationfromthesefourgroupswereinvestigatedrespectively.
Results:Cell-freesupernatantswithSDTwereassessedfortheirabilitytoattractTHP-(p<),whilethemonocytesmigrationoftheSDT-,therewasnostatisticdifferencebetweenthecontrolgroupandtheATPasegroup(p>).(p<),andtheSDT--fmkgroupshowednostatisticdifference(p>).
Conclusions:ThisstudydemonstratesthatSDTcouldinducetherecruitmentofmonocytesbypromotingthereleaseofATPinTHP-1macrophagesviacaspase-dependentpathway.
Keywords:ATP,atherosclerosis,sonodynamictherapy,macrophages
文献综述
动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种多因性疾病,近年来,尽管AS的诊断与治疗有了长足的进步,但人们对其病因学的结识仍然局限性。既往和晚近提出的AS发病学说,如血栓形成学说、脂质浸润学说、单克隆学说、损伤反映学说、剪切应力学说、同型半胱氨酸学说、精氨酸学说、内皮功能紊乱学说、氧化应激学说等都局限性以完全解释AS的发病基本[1]。近年来的基本研究与临床研究成果提示,AS炎症学说应重新受到注重。有充足的证据显示,在AS性疾病的不同临床体现形式中,炎症参与其发生和发展的所有环节[2]。这一发现,为临床治疗AS提供了理论根据及研发新药提供了新思路。

近年的研究表白,动脉粥样硬化病灶内脂质中心的大小、炎细胞特别是巨噬细胞的数量、纤维帽的厚薄及新生血管的多少是决定斑块稳定与否的最重要的因素,而巨噬细胞则通过对斑块内脂质含量、炎症反映、纤维成分的降解及新血管形成等方面来影响动脉粥样硬化病变的进展,从脂质条纹的发生到最后斑块破裂和血栓形成,巨噬细胞在动脉粥样硬化的所有阶段都起着极其重要的作用。

近年来,细胞凋亡在动脉粥样硬化的形成和进展中的作用日渐成为研究热点,斑块破裂伴血栓形成是导致动脉粥样硬化临床急性症状的重要因素,而大量的细胞凋亡直接导致斑块不稳定[3],凋亡过度是不稳定斑块的明显特性。据有关报道,在斑块的不同区域凋亡率具有一定的差别,富含巨噬细胞区细胞凋亡一般要高于其她区域[4]。斑块的“肩部”最容易发生破裂,纤维帽薄,具有大量激活的巨噬细胞,并存在凋亡残体及许多内含凋亡细胞的巨噬细胞和淋巴细胞,凋亡细胞和凋亡残体对巨噬细胞具有强烈的化学趋化活性,而巨噬细胞自身也遭受细胞凋亡所释放的细胞因子的影响而发生凋亡。巨噬细胞的吞噬作用在动脉粥样硬化不同的病变阶段有着很大的差别,因此在病变初期和晚期其凋亡对动脉粥样硬化的影响是不同的。在病变初期,巨噬细胞吞噬功能很强,重要针对脂蛋白,也可有效清除凋亡细胞,其体现的TG2不仅能增进凋亡细胞的清除,并且能限制活体内动脉粥样硬化病变的大小
[5],因此,动脉粥样硬化初期巨噬细胞凋亡可减少病变成分而克制病变进展[6]。
巨噬细胞能体现多种清道夫受体(scavengerreceptor,SR),涉及SR-A、SR-BI、CD36、CD68及SR-E(LOX-1)等,它迁入内膜后能通过其表面的SR摄取氧化修饰后的脂蛋白,绝大多数脂蛋白被转运到溶酶体中消化并降解为氨基酸和游离胆固醇,过多的游离胆固醇以胆固醇酯的形式储存在胞质里,从而转变为泡沫细胞[7]。粥样坏死中心的形成与泡沫细胞的汇集和凋亡密切有关。研究表白,斑块脂质中心有巨噬细胞抗体CD68的体现,阐明坏死物中有巨噬细胞的残片,这也间接支持粥样坏死中心是在泡沫细胞汇集凋亡的基本上形成的。并且,斑块中的脂质越多,其纤维帽中的巨噬细胞及T淋巴细胞也越多,阐明粥样坏死也许在单核细胞向内膜迁入过程中起一定的增进作用。在成熟病变中,吞噬细胞吞噬血小板、红细胞、凋亡细胞及脂蛋白,其中对凋亡细胞的吞噬有助于斑块的稳定,清除凋亡细胞的能力也许对急性粥样血栓性临床事件起决定作用[6]。但晚期病变中,许多因素可引起吞噬细胞清除凋亡细胞的功能受损,导致斑块内坏死、炎症及血栓形成[8]。斑块中细胞大量凋亡不仅直接导致脂质中细胞数量的减少,并且由于巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡后形成的凋亡物质难以清除,发生继发性坏死和炎症反映,细胞膜完整性破坏,脂质为主的胞浆内容物释放后堆积形成脂质池,从而增进斑块脂质中心的形成并逐渐增大。因此,在动脉粥样硬化晚期,巨噬细胞的凋亡对斑块的稳定是不利的。加强巨噬细胞整体的吞噬功能并非完全有益,然而选择性加强其对凋亡细胞的摄取,也许有助于动脉粥样硬化病变的克制。

在动脉粥样硬化斑块中发现血管平滑肌细胞和巨噬细胞都经历着凋亡与坏死,而凋亡占主导地位。血管平滑肌细胞分散于粥样病灶内皮下纤维部分及斑块纤维帽深部中膜的下层,而巨噬细胞成簇分布于内皮下、富含脂质的病灶中心和纤维帽的肩部。因此,平滑肌细胞源性泡沫细胞的凋亡重要发生在纤维区,而巨噬细胞源性泡沫细胞的凋亡重要发生在病变的脂质核心处,后者比前者更易发生凋亡,特别是在脂质核内和脂质核周边,在脂质核的非细胞部分可发现其凋亡残留物。
平滑肌细胞凋亡和巨噬细胞凋亡对动脉粥样硬化病变的意义不同,在斑块易损部位平滑肌细胞凋亡能引起纤维帽的强度削弱,平滑肌细胞凋亡只是斑块破裂的一种征兆,并非会直接导致斑块破裂,平滑肌细胞凋亡不也许通过纤维帽变薄来增进斑块破裂[9]。有研究报道,巨噬细胞分泌的Fas配体可诱导血管平滑肌细胞凋亡[10],而血管平滑肌细胞凋亡也可增长巨噬细胞凋亡,由于这能减少巨噬细胞因过度体现基质金属蛋白酶(MatrixMetalloproteinase,MMP)而对细胞外基质的破坏,因此有助于斑块的稳定[11]。

动脉粥样硬化是多因素作用的复杂病变,在其发生发展中巨噬细胞有着重要的作用,克制巨噬细胞内脂质汇集、减轻炎症反映,以及选择性调控其凋亡程序将成为动脉粥样硬化新的有效的治疗手段。目前临床上已有多种对抗动脉粥样硬化的治疗措施,如降脂治疗、她汀类药物的应用及血管源性细胞活素疗法等,都直接或间接地影响着巨噬细胞的凋亡。相信,随着蛋白组学和基因芯片等技术的逐渐完善,我们将会对动脉粥样硬化中巨噬细胞的凋亡进行更有利的调控,从而使动脉粥样硬化有更好更广阔的临床治疗前景。


1989年国际超声学会议上,日本学者UmemuraS初次提出了SDT这一概念。SDT是指对肿瘤患者静脉注射声敏剂后,应用一定频率和强度超声作用于肿瘤部位,使汇集在肿瘤部位声敏剂产生抗肿瘤因子从而对肿瘤细胞进行杀伤,克制肿瘤的进一步生长。SDT有其独特的优越性:无创性、超声治疗装置简朴易操作、靶向治疗、特异性强、副作用小。

SDT作用机制目前仍不清晰,重要的有超声空化效应、自由基理论、单线态氧机制等。

超声空化效应是指液体中的微小气泡(空穴)在声波作用下所发生的振荡、扩大、收缩乃至崩溃等一系列动力学过程,从而产生如化学反映、发光、次谐波等现象。

自由基理论觉得由于超声的空化作用激活空化泡内或临近的光敏剂,通过直接热分解弱键或与水热分解形成的·H和·OH反映产生光敏剂来源的自由基,自由基与O2反映形成烷氧自由基和过氧基对有机溶液中的有机分子反映活性低,更容易达到靶细胞而发挥作用[14]。

超声过程中超声空化导致声致发光,光激活空化泡内或临近的光敏剂分子而产生单线态氧。O2具有细胞毒性作用,其较大的扩散半径,能穿透线粒体膜,参与电子传递和氧化作用;能穿透核膜,导致DNA的损伤;导致胞膜脂质过氧化而杀伤细胞等。

目前研究中所使用的声敏剂重要分为三类[15]:卟啉类化合物、抗炎药物、抗癌症药物。抱负的声敏剂不仅规定化学纯性、有效的声敏化作用,还要对靶组织有较好的选择性,对人体毒副作用小,可以迅速的从体内排除等,目前觉得较好的声敏剂仍是以卟啉类为主。卟啉类化合物作为声敏剂用于临床诊断和治疗恶性肿瘤已有20近年,其能在肿瘤部位汇集,卟啉由通过超声产生的能量转移给电子而激发,产生具有细胞毒性的自由基。