文档介绍：何谓 PCR
简单的说,PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内 (In Vitro) 的大量合成。,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。 
PCR的要素  (Template) (Primers).  (Taq. Polymearse) 。PCR的反应包括三个主要步骤,分别是1). Denaturation 2). Annealing of primers, and 3). Extension of primers。 所谓 Denaturing乃是将DNA加热变性, 将双股的DNA加热后转为单股DNA以做为复制的模板. 而Annealing 则是令 Primers于一定的温度下附着于模板DNA两端。 最后在DNA聚合酶 (. Taq-polymerase) 的作用下进行引物的延长 (Extension of primers)及另一股的合成。
荧光PCR/实时定量PCR技术应用简介(fluorogenic quantitative PCR, FQ PCR)
荧光PCR原理
 (FRET)
某荧光标记基团在激发光刺激下生成某波长的发射光,当另一屏蔽基团与其距离合适时,原发射光将会被屏蔽基团所吸收,并转化为其他波长的发射光或热能,称之为FRET。
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荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。荧光信号的强弱与PCR的产物数量成正比,根据测量到的荧光信号强弱,通过分析软件得到样本的原始拷贝数。
荧光定量PCR技术
是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
扩增
5’
3’
5’
5’
3’
5’
正向引物
反向引物
TaqMan® 探针
R
Q
报告荧光
淬灭基团
报告荧光
淬灭基团
置换
5’
3’
5’
5’
3’
5’
R
Q
正向引物
TaqMan® 探针
反向引物
切割
5’
3’
5’
5’
3’
5’
Q
R
正向引物
反向引物
扩增完成
5’
3’
5’
5’
3’
5’
R
Q
正向引物
反向引物
Ct值
C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
Ct值与起始模板的关系
研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表Ct值。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
2. FQ—PCR的优点 FQ—PCR技术是融合了PCR技术与DNA探针杂交技术的优点,实验的整个过程只在加样时打开1次反应管,在PCR的每个循环中可以直接监测到荧光信号的变化,根据PCR反应酶动力学特点分析软件会自动对DNA进行定量,因此也有人称FQ-PCR为实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR)。其优点为:①FQ-PCR解决了传统PCR技术不能定量和扩增产物污染的问题。②避免了普通定量PCR操作过程中的污染,FQ-PCR只在加样时打开反应管1次。③FQ-PCR操作简便、快捷、结果准确,不需要普通PCR扩增后进行电泳或放射自显影观察结果,方便了临床上应用。④FQ-PCR可以对每一批扩增样本进行扩增效率的评价。对DNA做系列稀释,每个稀释浓度的DNA对数值与其Ct值做回归分析,PCR的扩增效率的计算方法为:效率=10-1/斜率。通过计算扩增效率可以对仪器、操作人员和试剂进行综合评定。