文档介绍：实验四酶联免疫吸附试验(ELISA)
它是一种把抗原抗体反应的特异性和酶催化底物的专一性有机结合起来的血清学方法。
通过化学方法将酶与抗原或抗体结合形成酶标记物,酶标记物仍然保持其免疫反应性及酶活性。将它与相应的抗体或抗原发生反应,从而形成酶标记的免疫复合物。
结合在免疫复合物上的酶,在遇到相应的底物时,催化其水解或发生氧化-还原反应等生成有色产物。酶降解底物的量与呈现色泽成正比,从而可以反映被测定的抗原或抗体的量。
目的要求:
掌握ELISA的原理与基本操作步骤
材料
(1)器材:
37℃培养箱,酶标读数仪,聚苯乙烯微量反应板,微量加样器及其他常用器材。
(2)试剂
(包被液) PBS(稀释缓冲液)
% PBS(洗涤缓冲液)
底物溶液-TMB溶液(3、3‘、5、5’-四***联苯***)
2M H2SO4(终止液)
抗原: 鸡IgG
被检血清: 兔抗鸡IgG
酶标二抗: HRP标记的羊抗兔IgG
方法
,将抗原稀释至100μg/ml,,置湿盒中, 37℃温育2小时转入4℃18小时以上。
,用洗涤缓冲液洗三次,每次三分钟。
%明胶封闭, 37℃ 40min。
方法
(一抗)
将待检血清按1:50,1:100,1:200,1:400,1:800稀释。
阳性血清、阴性血清均用稀释缓冲液作1:400倍稀释,,37 ℃温育1小时。
,用洗涤缓冲液洗三次,每次三分钟。
,,置湿盒中,37 ℃温育1小时。
方法
6. 洗涤倾去孔内液体,用洗涤缓冲液洗三次,每次三分钟。
。置湿盒中, 37 ℃温育10分钟。(颜色为蓝绿色)
2M ,终止反应(颜色为金黄色)。
结果判定
:
凡呈色深于阴性对照孔者判定为阳性结果,呈色与阴性对照孔相似或浅于阴性对照孔者判定为阴性结果。
:用酶标读数仪测读各反应孔在λ=450nm处的光密度值,按下式计算:
P/N=待检孔OD值/阴性对照孔OD值。
P/N值≥,P/N值≦,-。
包被
洗涤
加一抗即待检血清
间接ELISA法检测抗体的方法步骤
加酶标二抗
洗涤
洗涤
加底物溶液显色
加终止液
结果判定