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辽阳鑫宇实验室设施安装工程有限公司技术部
序言
基因扩增检验实验室一文,是依照国家相关法律、法规和技术规
范,进行选编、择录和收集相关资料、文章而编写的。选编和择录有
关技术规范等,如有错误是编著人理解有误,编者表示对不起。
本文的平面图由黄海江、收效图赵玉、录入周悦同志完成。
柏松枫、何兴福、张璐、张伟卓、赵馨、赵俨、熊洁萌等编写。
陈洪柱参加校订。
总经理郎宪明(高级工程师)编导。
本文为内部参阅资料,仅供参照。
2015年2月
基因扩增(PCR)实验室
基因扩增检验方法(简称PCR)矫捷度高、特异性强、精确快捷、
适用范围广等特点。在生物学、医学科学研究、转基因产品、临床检
测、疾病与动物疫病预防和控制、公安侦探等相关专业和学科广为应
用。但是,PCR检验实验室应用时需保证明验安全、设置合理的实验
室、规范的操作程序和严格的管理制度。
近几年,对PCR实验室建设越来越获取重视,由于对检测结果的
可靠性、正确性和安全性起到至关重要作用,PCR实验室设计核心问
题是如何防范污染。实验室的平面布局、空调通风系统运行、气流控
制等都是围绕防范污染这个核心进行设计和建设。
PCR实验室组合形式
PCR实验室能够是分别形式,也能够是组合形式,现在主若是以
组合形式为主。
分别形式PCR实验室
各功能区间分别,又有必然的间距,不会造成区间搅乱,因此没
有特定要求。由于工作流程的不便利,在新组建的PCR实验室时经常
不被采用。
组合形式PCR实验室
在较大空间实验用房相邻部署依次划分各功能地域,形成一个组
合形式完成基因扩增解析的PCR实验室,各区间在物理空间上完好相
互独立,各区间无论是在空间还是在使用中,向来处于完好的分开状
态。但是,各实验区间集中部署,简单造成相互搅乱,因此对整体布
局以及屏障系统拥有必然要求。对实验室的空调通风系统、气流流向、
大气压力、人物流程等方面,在实验室设计和装修上需进行合理考虑。
PCR实验室的地域设计
PCR实验室分区
PCR实验室可分两个工作地域:核酸扩增前区和核酸扩增后区。
核酸扩增前区包括试剂准备区和样品办理区,设在不同样房间或地域;
核酸扩增后区包括扩增区和产物解析区,设在不同样房间或地域。
PCR实验室依照使用仪器的功能合理设置各个地域,如
采用聚合酶联反应:则设置试剂储蓄和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物解析区四个单独的工作地域。样品需要粉碎办理的,还需增设样品粉碎区;若使用实时荧光PCR法:基因扩增区、基因产物解析区能够合并;采用标本办理、核酸提取及扩增检测为一体的全自动化PCR解析仪,则标本制备区、扩增区、扩增产物解析区可合并为一个地域,因此PCR实验室原则上设置五个区或四个区或三个区或二个单
独的工作区。
核酸扩增前区和核酸扩增后区可设在一个房间内,但必
须在满足以下要求的前提下:
核酸扩增前区实验室内设置两个不同样地址的实验区,
试剂配置在超净工作台中操作,样品办理在生物安全柜内操作。
在核酸扩增后区使用全封闭的扩增和检测系统时,如
实时荧光PCR仪等。
每个实验人员使用各自的试剂、耗材、移液器和盛放
污染物的盛器。
在实验前后对操作地域和共享用具进行干净及消毒。
各地域的试剂、用具、仪器和设施为该区专用,不得
交织使用。
PCR实验室各地域功能:
试剂储蓄和准备区:扩增试剂的制备、试剂的分装和扩
增反应混杂液的制备以及离心管、吸优等耗资品的储蓄和准备。
标本制备区:样品登记、办理和分装;核酸(RNA/DNA)
提取、保存和使用;PCR扩增的第一轮加样。关于涉及样本的操作应
吻合生物安全二级实验室防范标准或更高。
基因扩增区:cDNA合成和DNA扩增。若是在此区进行套
式PCR的第二轮加样,应在PCR防范罩内进行。
扩增产物解析区:扩增产物的电泳、杂交、成像、序列
测定、变性高效液相解析、结果解析、登记及报告。
工作地域设施和仪器的配置。
试剂储蓄和准备区
2-8℃和-20℃以下的冰箱、一般离心计、超净工作台、混匀器、
微量加样器(覆盖μL),耗资品(一次性手套、耐高压办理的离心管
和加样吸头)、专用工作服工作鞋(套)、专用办公用品和荒弃物容器、
可搬动紫外线灯。
标本制备区
2-8℃冰箱、-20℃(或-80℃)冰箱,生物安全柜、高速制冷离
心计(台式)、混匀器、恒温水浴箱或加热模块、制冰器或制冷模块、
微量加样器、耗资品(一次性手套、耐高压办理的离心管和加样吸头)、
专用工作服工作鞋(套)、上下水设施、专用办公用品和荒弃物容器、
紫外线杀菌灯。如需办理大分子的DNA应拥有超声波水浴仪。
扩增区
核酸扩增仪、微量加样器、耗资品(一次性手套、耐高压办理的
离心管和加样吸头)、专用工作服工作鞋(套)、专用办公用品和荒弃
物容器、紫外线杀菌灯。
扩增产物解析区
视检验方法不同样而定,基本配置以下:电泳仪、电泳槽、摄影/
像设施、变性高效液相解析仪、测序仪、紫外透射仪、一般冰箱、离
心计、恒温水浴、微波炉、上下水设施、紫外线灯、微量加样器、消
耗品(一次性手套、耐高压办理的离心管和加样吸头)、专用工作服
工作鞋(套)、专用办公用品和荒弃物容器。
各地域设施和仪器的装备,应依照使用的扩增检测技术或试剂特
点,对设施和仪器进行必要的增减。
PCR实验室单向流流向制度
实验室的空气单向流流向应该为:试剂储蓄和准备区→
样品制备区→扩增区→扩增产物解析区,不得逆向流动。扩增前区保
持微(弱)正压状态,扩增后区保持微(弱)负压状态。
实验用品单向流工作流向应该为:试剂储蓄和准备区→
样品制备区→扩增区→扩增产物解析区,不得逆向进行。实验用品包
括实验资料(试剂、样品和扩增产物)、实验器材(容器、板架、实
验衣饰、帽子、口罩、手套、鞋套)、办公用品(记录纸、笔)、以及
干净工具等。物品的传达是经过互锁式传达窗传达。
实验人员单向工作流流向应该为:进入各工作地域严格
依照试剂储蓄和准备区→样品制备区→扩增区→扩增产物解析区单
一方向进行,不得逆向走动。原则上实验人员应在扩增后区工作后当
天不得再返回扩增前区工作。在标本制备区由于加样的操作中可能会
发生气溶胶污染,因此应防范或减少在本区内不用要的走动。
实验室的单向干净流流向应该为:试剂储蓄和准备区→
样品制备区→扩增区→扩增产物解析区的方向进行。不同样的实验地域
应该有各自的干净用具,以防范交织污染。
PCR实验室工作基本源则和实验室各地域工作注意事项
严格的实验室分区制度;各地域必定有明确的标记,只
用于特定的操作,不得从事其他工作;不同样地域的设施物品(仪器、
设施、资料、干净工具),不得交织使用。
不同样工作地域使用不同样工作服(比方不同样颜色),工作人
员走动工作地域时,不得将工作服带出。
实验前移入所需试剂、耗材、样品以及盛放污染物的容
器。
试剂储蓄和准备区:储蓄试剂和用于标本制备的耗资品
等资料须直接运送至本区,不能够经过扩增检测区。试剂盒中的阳性对
照品及质控品不能够保存在本区,应该保存在标本制备区。
标本制备区:由于在样品混杂、核酸纯化过程中可能会
发生气溶胶所致污染,可经过在本区内设正压条件,防范从周边地域
进入本区的气溶胶污染。为防范标本间的交织污染,加入待测核酸后,
必定盖好含反应混杂液的反应管。对拥有潜藏传染危险性的资料,必
须在生物安全柜内操做,并有明确的标本办理和灭活程序。
扩增区:为防范气溶胶所致的污染,应该尽量防范或减
少本区内的人员不用要的走动。必定注意全部经过检测的反应管不得
在本区内打开。
扩增产物解析区:核酸扩增后产物的解析方法很多,如
膜上或微孔板或芯片上探针杂交方法(放射性核素标记或非放射性核
素标记)直接或酶切后琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰***凝胶电泳
southern转移、核酸测序方法、质谱解析等。本区是最主要的扩增
产物污染本源,因此,必定注意防范经过本区物品及工作服将扩增物
带出。在使用PCR-ELISA方法检测扩增产物时,必定使用洗板机洗板,
废液必定收集在1moL/LHCL中,不能够在实验室内倾倒,应该远离
PCR实验室的地方弃掉。用过的吸头也必定放在1moL/LHCL中侵泡
后再放到荒弃物容器或垃圾袋中按程序办理。
工作结束过后,须对工作区进行干净办理:对工作地域
的实验台面进行干净消毒(如使用次***酸钠),实验台面采用紫外线
照射更为方便、收效更佳。由于紫外线照射的距离和能量关于去污的
收效特别要点,可使用搬动紫外线灯(254nm波长),在工作完成后
调至实验台面上60-90cm范围内照射。由于扩增产物仅几百和几十碱
基对(bp),对紫外线伤害不敏感,因此紫外线照射扩增片段必定延长
照射时间,最好是照射过夜。
由于本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质,如溴化乙
锭、丙烯酰***、甲醛或放射性核素等,故应该注意实验人员的安全防
护。
PCR实验室建设与装修
依照使用采用仪器的不同样确定五个或四个或三个或二个地域,各
地域必定设置缓冲间,缓冲间宜设正压,使室内空气不流向室外,室
外空气不流向室内,以减少室内外空气交换。也可设专用走廊,但缓
冲间比专用走廊更为重要。
PCR实验室空气流向,可依照试剂储备和准备区→标本制备区
→扩增区→扩增产物解析区方向进行空气压力递减方式控制气流流
向,防范扩增产物顺空气气流逆向进入扩增前的地域。也可经过负压
排风装置、排风扇或其他可行的方式进行。
压差与净化级别
试剂储藏和准备区、样品办理区应设微正压,以防范外
界核酸气溶胶的进入,造成污染,能够经过空气进风风量的大于排风
量达到正压收效。
核酸扩增区、产物解析区应设微负压,防范含核酸的气
溶胶扩散出去而污染试剂与样品,造成假阳性结果,能够经过控制排
风风量大于进风风量达到负压收效。
PCR实验室并没有严格的净化要求,若需要一般采用净
化级别8或9级(即万级或十万级)。
PCR实验室空调通风系统及压力控制
为防范各个实验地域间交织感染的可能性,宜采用全送全排的气
流组织形式。同时要严格控制送排风的比率,以保证各实验区的压力
要求。
试剂储蓄和准备区:由于该区主要进行的操作为储蓄试
剂的制备、试剂的分装和主反应混杂液的制备,关于气流压力的控制,
本区没有严格要求,但宜采用微正压。
标本制备区:该地域主要进行的操作为标本的保存、核
酸(RNA、DNA)提取、储蓄即加入至扩增反应管和测定RNA和DNA的
合成体。本区的压力梯度要求与相对相周边地域为正压,是为防范从
周边区进入本区气溶胶污染。
扩增区:扩增反应混杂物配制和扩增反应,该地域主要
进行的操作为DNA和CDNA扩增。其他,已制备的DNA模板和合成的
CDNA(来自标本制备区)的加入和主反应混杂液(来自试剂储蓄和制
备区)制备成反应混杂液等也可在本区内进行。在巢式PCR测试中,
平时在第一轮扩增后必定打开反应管,由于巢式扩增有较高的危险
性,第二次加样必定在本区内进行。因此,本区压力梯度要求为相对
周边地域为负压,以防范气溶胶从本区泻出。