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亚砷酸钠对小鼠肝细胞AML12氧化应激、凋亡及MST1、MST2蛋白表达的影响.pdf

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亚砷酸钠对小鼠肝细胞AML12氧化应激、凋亡及MST1、MST2蛋白表达的影响.pdf

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47 .
年月47 1
JOURNALOFGUIZHOUMEDICALUNIVERSITY .
2022120221
·专题研究·
亚***酸钠对小鼠肝细胞氧化应激、凋亡及、
∗AML12MST1
蛋白表达的影响∗
MST2
,,,
赵哲仪12∗∗,王正蓉23,方兴艳2,王甜4,罗昭逊5∗∗∗,谢婷婷12∗∗∗
贵州医科大学附属医院临床检验中心贵州贵阳贵州医科大学医学检验学院贵州贵阳贵州医科大学附
(1., 550004;2., 550004;3.
属医院产前诊断中心贵州贵阳山东省立第三医院检验科山东济南贵州医科大学儿科学院贵州贵阳
, 550004;4., 250031;5.,
550004)
[摘要]目的探讨亚***酸钠对小鼠肝细胞氧化应激凋亡及哺乳动物不育系样激酶
(NaAsO2)AML12、201
蛋白表达的影响方法取对数生长期的小鼠正常肝细胞分为对照组不含
(MST1)、MST2。 AML12,(NaAsO2)
及实验组及处理采用荧光探针染色法和化学比色法分别检测各组小鼠
(10、15、20、2530μmol/LNaAsO224h),
细胞内活性氧含量和超氧化物歧化活性水平采用检测各组小鼠细胞
AML12(ROS)(SOD),WesternblotAML12
的磷酸化及半胱氨酸蛋白酶剪接体蛋白相对表达量
MST1、MST2、MST1/2(p-MST1/2)3(c-caspase3)。
结果与对照组相比随着浓度的增加各实验组小鼠细胞内含量逐渐升高P
,NaAsO2,AML12ROS(<),
活性逐渐降低P与对照组相比各实验组小鼠细胞内蛋白相对表达量升高
SOD(<);,AML12p-MST1/2
P组小鼠细胞内为蛋白相对表达量降低蛋白相对
(<),20~30μmol/LNaAsO2AML12MST1、c-caspase3
表达量升高P组小鼠细胞内蛋白相对表达量升高P
(<),15~30μmol/LNaAsO2AML12MST1(<)。
结论可促进小鼠肝细胞发生氧化应激凋亡及蛋白表达异常
NaAsO2AML12、p-MST1/2、MST1、MST2。
[关键词]细胞凋亡亚***酸钠肝细胞氧化应激哺乳动物不育系样激酶哺乳动物不育系
;;AML12;;201;20
样激酶
2
[中图分类号][文献标识码][文章编号]
A 2096-8388(2022)01-0007-06
DOI
:.2096-
Effectsofsodiumarseniteonoxidativestressapoptosisandthe
,,
expressionofMSTMSTinmousehepatocytesAML
1,212
1,22,32451,2
ZHAOZheyi,WANGZhengrong,FANGXingyan,WANGTian,LUOZhaoxun,XIETingting

(,,,,;

,,,,;
DiagnosisCentertheAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversityGuiyang550004GuizhouChina
,,,,;

,,,,;

,,,,)
AbstractObjective
[] Toinvestigatetheeffectsofsodiumarsenite(NaAsO2)onoxidativestress,
apoptosisandexpressionofmammaliansterile20-likekinases1(MST1),MST2inmousenormal
Methods
hepatocytesAML12. MousenormalhepatocytesAML12atlogarithmicgrowthstagewere

,15,20,25,and30μmol/LNaAsO2for
(ROS)andtheactivityofsuperoxide
dismutase(SOD)
基金项目国家自然科学基金贵州省科技创新人才团队项目
∗∗[](81560514);(2019-5610)
贵州医科大学级硕士研究生
∗∗2018
通信作者
∗∗∗E-mail:******@;******@
万方数据
7
贵州医科大学学报卷
47
relativeexpressionlevelsofp-MST1/2,MST1,MST2,andcleavedcaspase3(c-caspase3)protein
Results
weredetectedbyWesternblot. Comparedwiththecontrolgroup,theROScontentofAML12
P
cellsincreasedgradually(<),whiletheactivityofSODdecreasedgraduallyalongwiththe
P
increaseofNaAsO2concentration(<);Comparedwiththecontrolgroup,therelativeexpressionof
P
p-MST1/2proteininNaAsO2groupsincreasedgradually(<),therelativeexpressionofMST1
P
proteinin20-30μmol/LNaAsO2groupsdecreased(<),therelativeexpressionofc-caspase3
in20-30μmol/LNaAsO2groupsandtherelativeexpressionofMST2in15-30μmol/LNaAsO2
PConclusion
groupsincreased(<). NaAsO2mayinduceoxidativestress,apoptosis,andthe
abnormalexpressionofp-MST1/2,MST1andMST2inmousenormalhepatocytesAML12.
Keywords
[]apoptosis;sodiumarsenite(NaAsO2);AML12hepatocytes;oxidativestress;mammalian
sterile20-likekinases1(MST1);mammalianserile20-likekinases2(MST2)
地方性***中毒是严重危害人体健康的生物地及磷酸盐缓冲溶液美
(phosphatebuffersaline,PBS;
球化学性疾病之一目前已发现的地方性***中毒病国公司胎牛血清
,Gibco),(fetalbovineserum,FBS;
区遍布于全球多个国家至少有亿人面临***美国公司青霉素链霉素美国
70,2Corning),、(Hyclone
暴露的风险[1]***中毒是以多脏器多系统损害为公司细胞培养瓶培养皿无锡耐思生物科技有
。),、(
特点的全身性疾病肝脏亦是***毒作用的主要靶器限公司细胞冻存液普通裂解液蛋白
,),、RIPA、5×
官之一[2]研究发现***所致机体内氧化与抗氧上样缓冲液蛋白和聚丙烯酰***凝胶电泳
。,、marker
化作用失衡细胞凋亡信号通路异常是***中毒的重
、(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelect
要机制[3-4]哺乳动物不育系样激酶凝胶制备试剂盒及超氧化
。201(mam-rophoresis,SDS-PAGE)
和是不物歧化酶活性检测试
maliansterile20-likekinases1,MST1)MST2(superoxidedismutase,SOD)
育系样激酶家族中具有进化保守性的编码丝剂盒北京索莱宝生物有限公司化学发光试剂
20、(),
氨酸和苏氨酸蛋白激酶的同源基因[5]以往动物美国公
。(electrochemiluminescence,ECL;Millipore
及细胞水平的研究表明和能通过调司活性氧检测试
,MST1MST2),(reactiveoxygenspecies,ROS)
节多条信号通路促进氧化应激和凋亡且磷酸化剂盒南京建成生物工程研究所二辛可宁酸
,(),
能通蛋白浓度测定试剂盒上
MST1/2(phosphorylated-MST1/2,p-MST1/2)(bicinchoninicacid,BCA)(
过激活信号通路抑制一系列抗氧化及抗凋海碧云天生物技术研究所兔抗小鼠
Hippo),p-MST1/2
亡因子的表达[6-8]尽管和与***毒性单克隆抗体美国公司兔抗小鼠
。MST1MST2(CST),MST1、
作用相关的信号通路存在相互作用关系[9-10]但甘油醛磷酸脱氢酶
,MST2、-3-(glyceraldehyde-3-
目前未有报道表明***对肝细胞及单克隆抗体及辣
p-MST1/2、MST1phosphatedehydrogenase,GAPDH)
表达水平的影响因此本研究用亚***酸钠根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白二抗
MST2。,G
对正常肝细胞进英国公司兔抗小鼠半胱氨酸蛋白酶
(sodiumarsenite,NaAsO2)AML12(Abcam),3
行染毒处理探究***对肝细胞氧化应激凋亡以及剪接体单克隆抗
,、(cleavedcaspase3,c-caspase3)
表达的影响为***所致肝损伤疾病的防治体沈阳万类生物科技有限公司
MST1/2,()。

。 (OLym-
公司酶标仪美国公司
pus),ELX800(Bio-Teck),
倒置荧光显微镜日本公司小型垂直电泳
(Nikon),
1材料与方法槽美国公司
(Bio-Rad)。


、染毒处理及分组小鼠
NaAsO2

AML12AML1210%FBSDMEM/F-12
中国科学院细胞库培养基于恒温条件下培养待细胞
。,5%CO2、37℃;

NaAsO2(Merck80%,、。
司胰蛋白酶溶液培养基规培养时每隔进行换液传代比例为待
),、DMEM/F-12,2d,1∶2;
万方数据
8
期赵哲仪等亚***酸钠对小鼠肝细胞氧化应激凋亡及蛋白表达的影响
1 AML12、MST1、MST2
细胞融合率达时弃原培养基素方差分析法进一步两两比较采用最小显著性差
80%,,0、10、15、20、,
及的完全培养基溶液继续异法-tP
2530μmol/LNaAsO2(leastsignificancedifferencettest,LSD);<
培养以不含为对照组其余各浓度为差异有统计学意义
24h,NaAsO2,。
处理组为实验组
NaAsO2。

AML12ROS
含量取处于对数生长期的细胞接种于2结果
AML126
孔板中实验组染毒处理后弃各组细胞
,NaAsO2,

,10μmol/L ROS
的培养基继续于倒置荧光显微镜结果表明与对照组相比随
(DCFH-DA)DMEM/F-121mL,,
孵育细胞弃含染料的培养基洗涤着浓度的增高各
37℃1h;,PBSNaAsO2,10~30μmol/LNaAsO2
细胞次加适量于倒置荧光显微镜下观察组小鼠细胞内的荧光强度逐渐增强
2,PBSAML12ROS,
细胞内的荧光强度且差异均有统计学意义P见图
。(<)。1。

AML12SOD SOD
取处于对数生长期的细胞接种于孔板化学比色法检测结果表明与对照组相比
AML126,,
中实验组染毒处理后消化收集各组细各组小鼠细胞内
,NaAsO2,10~30μmol/LNaAsO2AML12
胞至离心管按每万细胞加蛋白提取液活性降低差异均有统计学意义P
,5001mL,SOD,(<)。
行超声破碎裂解细胞后下离心见图
,4℃8000r/min2。
、、和蛋白表达
10min,, p-MST1/2MST1MST2c-caspase3
制活性检测反应体系行吸光度检测计算每结果显示与对照组相比
SOD,Westernblot,,10~
克样本质量中的含量每组样本设置个复组小鼠细胞内
MDA;330μmol/LNaAsO2AML12p-MST1/2
孔并重复次实验蛋白相对表达量增加P
,3。(<),20~30μmol/L

WesternblotAML12p-NaAsO2AML12MST1
、、及蛋白相对表达达量降低蛋白相对表达量升高P
MST1/2MST1MST2c-caspase3、c-caspase3(<
量取处于对数生长期的细胞接种于孔组小鼠细
),15~30μmol/LNaAsO2AML12
板中实验组染毒处理后弃各孔中原培胞内蛋白相对表达量升高P见
,NaAsO2,MST2(<)。
养基按的比例加入蛋白裂解液蛋白酶图
,100∶1∶1、3。
抑制剂及蛋白磷酸酶抑制剂提取总蛋白经
;BCA
法测定蛋白浓度再将蛋白样品与倍体积的3讨论
,1/45
上样缓冲液充分混匀置于金
×SDS-PAGE,100℃
属浴中加热各组蛋白均以上样量进是一类具有高化学反应活性的含氧物
8min;40μgROS
行电泳分离转移至膜上质其主要来源于线粒体内的氧化呼吸链[11]当
SDS-PAGE,PVDF,5%,。
封闭洗膜次次分别加机体发生氧化应激时体内的抗氧化物质不足以清
BSA2h,TBST3、10min/,,
抗体抗体除氧化物质使得过度积累最终导致组织细
p-MST1/2(1∶1000)、MST1(1∶10000)、,ROS,
抗体及抗体胞损伤[12]作为生物体内的一线抗氧化酶
MST2(1∶10000)c-caspase3(1∶。SOD,
和抗体于孵育过在清除维持氧化与抗氧化平衡中具有重要
1000)GAPDH(1∶10000)4℃ROS、
夜洗膜次次加山羊抗兔二作用其水平高低可直接反应体内氧化应激状
;TBST3、10min/,IgG,
抗于室温孵育洗涤次态[13]而作为连接氧化应激和凋亡的枢纽
(1∶10000)2h,TBST3、。ROS,
次显影采用软件统计蛋白可通过多种途径激活凋亡信号通路进而促进
10min/,ECL;ImageJ,
条带灰度值以为内参照计算各目的蛋白发生裂解而活化最终导致细胞凋亡[14]
,GAPDHcaspase-3,。
的相对表达水平本研究通过体外构建***暴露细胞模型发现随着染
。:
***剂量的增加细胞内含量逐渐增加
,AML12ROS,
采用软件进行数据统计学分析所活性逐渐下降蛋白相对表达量逐
,SOD,c-caspase3
有计量资料均进行正态性检验方差齐性检验计渐增加提示***可以明显诱导细胞发生氧
、;,AML12
量资料呈正态分布且方差齐时组间比较采用单因化应激和凋亡
,。
万方数据
9
贵州医科大学学报卷
47
()()
注:为荧光探针染色法检测结果(),为荧光强度的定量结果;1与对照组比较,P;2与组比较,
A200×B<
()()()
P;3与组比较,P;4与组比较,P;5与组比较,P。
<<<<
图1 各组小鼠AML12细胞的ROS表达
ThecontentsofROSinAML12hepatocytesofmiceineachgroup
和作为不育系样激酶家族中
MST1MST220
受到广泛研究的成员在细胞氧化应激凋亡增
,、、
殖分化等多种生物学过程中都发挥着重要作

用[15-16]研究表明属于信号通路
。,MST1/2Hippo
中关键的信号传导激酶可在氧化应激状态下发生
,
自磷酸化而被激活活化的可通过激酶级
,MST1/2
联反应抑制一系列抗凋亡因子的表达[17-19]此

外基因敲除实验表明敲低能降低的
,,MST1/2p53
()()表达量及的活性从而抑制细胞凋
注:1与对照组比较,P;2与组比较,caspase-3,
2
<[20-21]
()()亡本实验结果显示在诱导
P;3与组比较,P;4与。,NaAsO2AML12
<<
()细胞发生氧化应激和凋亡过程中和
组比较,P;5与组比较,P。,p-MST1/2
NaAsO2<<
图2 各组小鼠AML12肝细胞的SOD活性MST2,MST1
达量逐渐降低推测可能通过其磷酸化
TheactivityofSODinAML12hepatocytes,MST1/2
形式以及提高活性参与了***致肝损伤过
ofmiceineachgroupcaspase-3
万方数据
10
期赵哲仪等亚***酸钠对小鼠肝细胞氧化应激凋亡及蛋白表达的影响
1 AML12、MST1、MST2
()()
注:为检测各蛋白结果;为各蛋白表达的定量结果;1与对照组比较,P;2与组比较,P;
AWesternblotB<<
()()()
3与组比较,P;4与组比较,P;5与组比较,P。
15μmol/LNaAsO2<<<
图3 各组小鼠AML12细胞内p-MST1/2、MST1、MST2及c-caspase3蛋白的表达(Westernblot)
Theproteinexpressionlevelsofp-MST1/2,MST1,MST2,andc-caspase3in
AML12hepatocytesofmiceineachgroup(Westernblot)
程但其具体生物学机制有待深入研究与本实验降低时细胞仍然能发生凋亡2伴随着
,。MST1;()
结果类似的等[22]和等[23]分别在不同细活性的增高部分经切
,ShiWangcaspase-3,MST1caspase-3
胞发生凋亡的过程中发现或的割活化导致蛋白呈逐渐降低趋势
,p-MST1p-MST1/2,MST1。
表达量显著上升而的表达量显著下降综上所述可促进小鼠正常肝细胞
MST1。Lu,NaAsO2
等[24]还发现在紫外线引起表皮细胞凋亡过发生氧化应激和凋亡在此过程中
HaCatAML12,p-
程中随着紫外线作用时间的延长蛋白表及蛋白表达水平出现异常
,,MST1MST1/2、MST1MST2。
达量逐渐降低而分子量为的蛋白本研究仅初步验证了***对及
,34kDaMST1p-MST1/2、MST1MST2
片段逐渐增多在多种凋亡刺激作用下可蛋白表达水平的影响还需深入探讨在***
。MST1,,MST1/2
被切割成分子量为的高活性促致肝损伤过程中所调控的具体信号通路
caspase-334kDa。
凋亡片段该片段通过进入细胞核内磷酸化组蛋白
,
从而使得染色质固缩损伤最终导致
H2B,、DNA,4 参考文献
细胞凋亡[25-26]因此分析本研究中降低
。,MST1
的原因可能有1发挥促凋亡的作用可能
:()MST1[1]BJØRKLUNDG,OLIINYKP,LYSIUKR,
主要依赖于其磷酸化形式故在升高而
,p-MST1/2intoxication:generalaspectsandchelatingagents[J].
万方数据
11
贵州医科大学学报卷
47
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