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基于生物信息学和体外实验探讨粉防己碱治疗早期矽肺的关键通路.pdf

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基于生物信息学和体外实验探讨粉防己碱治疗早期矽肺的关键通路.pdf

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海南医学院学报2022,28(23)
1792JournalofHainanMedicalUniversity
DOI:.
网络出版地址:.
基于生物信息学和体外实验探讨粉防己碱治疗早期矽肺的关键通路
梁超1,周家伟1,刘亚锋1,郭健强1,王清森1,苏忆欣1,邢应如4,胡春晓1,谢军5,
吴静1,2,3,胡东1,2,3
(,安徽淮南232001;,安徽淮南232001;
职业健康安全安徽省教育厅重点实验室,安徽淮南232001;,安徽合肥230000;
附属肿瘤医院/淮南东方医院集团肿瘤医院,安徽淮南232033)
[摘要]目的:基于生物信息学和体外实验探究粉防己碱治疗早期矽肺发展的关键通路。方法:通过文
献挖掘收集矽肺患者的差异表达基因;利用高通量基因表达数据库(GEO)收集二氧化硅滴注小鼠的差异表
达基因;借助在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)、GeneCards、比较毒物基因组学数据库(CTD)获取矽肺
相关的疾病靶点;分别将差异表达基因和疾病靶点通过R语言及Metascape平台进行基因本体(GO)富集分
析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析;使用薛定谔(Schrödinger)及Pymol软件进行分子对接
及修饰;制备二氧化硅刺激的巨噬细胞和上皮细胞模型,通过PCR技术和蛋白免疫印迹(WB)验证分析结
果。结果:筛选出矽肺病人差异表达基因2065个,滴注二氧化硅大鼠差异表达基因2291个,矽肺相关疾病
靶点803个。GO富集分析主要涉及G蛋白偶联受体结合、调节炎症反应、参与免疫反应等。KEGG通路富
集分析主要包括细胞外基质-受体相互作用(ECM-receptorinteraction)、TNF信号通路、IL-17信号通路等。
不同来源的差异基因和疾病靶点同时筛选出IL-17信号通路。分子对接结果表明矽肺药物粉防己碱与IL-
17信号通路中的RAF/MEK/ERK通路有良好的结合效果。细胞实验表明粉防己碱通过调控RAF/MEK/
ERK通路降低巨噬细胞中TNF-α、TGF-β等炎症因子的表达,同时抑制上皮细胞中上皮间质转化及炎症因
子表达。结论:粉防己碱通过RAF/MEK/ERK通路调控炎症反应和上皮间质转化(EMT)从而影响早期矽
肺进展。
[关键词]矽肺;粉防己碱;生物信息学;分子对接;信号通路
[中图分类号][文献标识码]A[文章编号]1007-1237(2022)23-1792-11
Exploringthekeypathwaysoftetrandrineinthetreatmentofearlysilicosisbasedon
bioinformaticsandinvitroexperiments
LIANGChao1,ZHOUJia-wei1,LIUYa-feng1,GUOJian-qiang1,WANGQing-sen1,SUYi-xin1,XINGYing-ru4,
HUChun-xiao1,XIEJun5,WUJing1,2,3,HUDong1,2,3
(,AnhuiUniversityofScienceandTechnology,Huainan232001,China;
EngineeringLaboratory,Huainan232001,China;
andSafetyofEducationDepartment,Huainan232001,China;,GengjiuHospitalofAnhuiZhongke,
Hefei232001,China;
CancerHospital,Huainan232001,China)
[FoundationProject]:NationalNaturalScienceFoundationofChina(81971483);AnhuiUniversityCollaborativeInnovationProject
(GXXT-2020-058);AnhuiUniversityofScienceandTechnologyInnovationandEntrepreneurshipProject(2021CX2125,2021CX2126,
2021CX2124)
[Author]:LIANGChao,E-mail:******@.
[Correspondenceto]:WUJing,Professor,E-mail:******@;HUDong,Professor,E-mail:******@.
Received:2022-06-19Revised:2022-08-15JHMU,2022;28(23):1792-1802
[基金项目]国家自然科学基金项目(81971483);安徽省高校协同创新项目(GXXT-2020-058);安徽理工大学大学生创新创业项目
(2021CX2125,2021CX2126,2021CX2124)
[作者简介]梁超,E-mail:******@。
[通讯作者]吴静,教授,E-mail:******@;胡东,教授,E-mail:******@。
[收稿日期]2022-06-19[修回日期]2022-08-15网络出版时间:2022-08-1808:37:45:.

Viewfromspecialist:Itiscreative,andofcertainscientificandeducationalvalue.
[ABSTRACT]Objective:Exploringthekeypathwaysaffectingthedevelopmentofearlysilicosisbasedonbioinformaticsand
:Collectingdifferentiallyexpressedgenesinsilicosispatientsthroughliteraturemining;Collecting
differentiallyexpressedgenesinsilicondioxideinfusionmicebyusingahigh-throughputgeneexpressiondatabase(GEO);Obtain-
ingdiseasetargetsrelatedtosilicosisbymeansofonlinehumanMendeliangeneticdatabase(OMIM),GeneCardsandcompara-
tivetoxicgenomicsdatabase(CTD);differentiallyexpressedgenesanddiseasetargetsweresubjectedtogeneontology(GO)en-
richmentanalysisandKyotoEncyclopediaofGenesandGenome(KEGG)enrichmentanalysisviaR-packageandMetascapeplat-
forms,ö-stimu-
latedmacrophagesandepithelialcellsweremodeledandanalyzedbyPCRandwesternblot(WB).Result:2065differentiallyex-
pressedgenesinsilicosispatients,2291differentiallyexpressedgenesinratinfusedwithsilicondioxide,and803targetsforsilico-
sis--coupledreceptorbinding,theregulation
ofinflammatoryresponse,
ECM-receptorinteraction,TNFsignalingpathway,andIL--17signalingpathwaywasscreenedoutfrom
differentgenesanddiseasetargets,indicatingthatIL-17signalingpathwaymightbethekeypathwayforthedevelopmentofsilico-
-
wayintheIL-
suchasIL-6andTGF-βinmacrophagesbyregulatingtheRAF/MEK/ERKpathway,andinhibitedtheepithelial-mesenchymal
:Tetrandrineregulatestheinflammatoryresponse
andepithelial-mesenchymaltransition(EMT)throughtheRAF/MEK/ERKpathwayandthusaffectstheearlyprogressionofsili-
cosis.
[KEYWORDS]Silicosis;Tetrandrine;Bioinformatics;Moleculardocking;signalpathway
矽肺是由于吸入二氧化硅或二氧化硅刺激的平[8]。同时发现粉防己碱可以减少脂多糖诱导的巨
肺纤维化疾病,是最常见的职业性疾病之一。中国噬细胞的爆发[9],减少氧自由基的产生和肿瘤坏死
是矽肺患者最多的国家,平均年确诊病例超过5000因子-α(TGF-α)。白介素-6(IL-6)等炎症因子的积
例,死亡病例超过20000例。全球矽肺患者中欧洲累,延缓矽肺前期的炎症阶段,减少胶原纤维的产
超过300万,美国超过200万[1]。矽肺常与巨噬细胞生,改善肺部纤维化形成[10]。本研究基于前期课题
受体激活、炎症小体有关,二氧化硅吸入肺后被巨组的中药研究成果,采用矽肺患者基因、二氧化硅
噬细胞吞噬,巨噬细胞释放炎症因子刺激上皮细胞滴注小鼠基因和网络药理学三种数据集进行筛选
向间质细胞转化和成纤维细胞的募集,成纤维细胞和预测,通过分子对接和体外实验验证,探究粉防
被刺激后分化为肌成纤维细胞,产生胶原纤维[2,3]。己碱治疗早期矽肺的关键通路,为早期矽肺的治疗
已证明二氧化硅可以刺激PI3K蛋白激酶调节自噬提供理论依据。
体积累从而促进矽肺发展[4],也可以通过抑制NF-1资料与方法
κB或TGF-β抑制矽肺进程[5],
关键通路并不清楚,无有效的手段可以进行早期矽矽肺患者的相关芯片数据来源于文献,本研究
肺的识别、诊断和治疗[6],所以对早期矽肺的深入研收集了10例矽肺患者和7例正常人的肺组织RNA
究有着重要的临床意义和社会意义。测序数据进行分析,10例矽肺患者和7例正常人的
根据矽肺证型的特点,古代中医学家利用中药肺组织均来自于无锡市人民医院,肺组织在肺移植
以补为法,以通为用,通补兼施治疗矽肺,中药防己时获得,取样时避开了淋巴结和器官,所有参与者
就是其中之一[7]。防己入药历史悠久,在《神农本草都给出书面知情同意书且获得了南京医科大学机
经》《伤寒杂病论》《药性论》等古书中均有记载,防构审查委员会和中国医学科学院基础医学研究所
己在《神农本草经》中记载味苦性寒,具有治疗风湿的批准[11]。二氧化硅滴注大鼠的相关芯片数据来
水肿、湿疹脉浮的功效[7]。在现代医疗中具有抗肿自于GEO数据库[12](theGeneExpressionOmni-
瘤,抗风湿性关节炎,保护心血管等作用。研究表bus,GEO,/)。
明粉防己主要的化学成分是粉防己碱(tetrandrine),在GEO数据库搜索关键词“矽肺”,经筛选得到芯片
为喹啉类生物碱,具有抗肿瘤,抗炎、抗纤维化。抗原始数据GSE188520以及平台注释文件GPL2
矽肺等药理作用[7]。临床研究表明粉防己碱素治疗5290,其中GSE188520中样本包括6只普通大鼠和
矽肺的临床效果显著,可以改善患者的肺功能水6只二氧化硅滴注大鼠。通过使用limma包[13]对上:.

述芯片数据进行差异化分析,差异基因的筛选条件后,每孔加入MTS溶液20μL,再次放入培养箱4h
为P<,log(foldchange,FC)>1或<-1,将筛后测定吸光度值。
选后的基因按照logFC绝对值大小进行排序,-PCR测定细胞炎症因子表达
和下调排名前一百的基因进行后续分析。将细胞样品用PBS洗净加入1mLTrizol,在冰
,
在OMIM数据库[14]、CTD数据库[15]、GeneCardEP管中,加入***仿200μL,震荡混匀静置10min。
数据库[16]中以“矽肺”为关键词进行检索,运用靶点4℃12000r/min离心15min,用无RNA酶枪头吸
交集可视化工具[17]将交集靶点进行提取构建。取上清液加入到500μL异丙醇中震荡静置10min,
℃12000r离心10min收集RNA沉淀,用75%无
为说明筛选出的关键基因和靶点参与的信号水乙醇洗涤后离心5min去上清,自然风干后加入
通路和发挥的生物学功能,使用Rstudio软件并利适量DEPC水溶解沉淀。随后上机测RNA浓度,
用R/ggplot2、limma、pheatmap、ggsci、dplyr包对关各组RNA量调整到同一水平,配置逆转录体系。
键差异基因进行了基因本体分析和信号通路富集逆转录完成后将cDNA、荧光染料和不同引物配置
分析[18]。成不同的混合体系上机。
-
不同基因集筛选出来的通路进行交集得到关将细胞样品用PBS洗涤后,根据细胞量的多
键通路,将关键通路相关靶点导入STRING数据少,加入还有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液,4℃冰
库[19],物种设置为“Homesapiens”,保存下载文件为箱放置30min后,取细胞混合液离心,去上清取沉
tsv格式,,测量不同组的细胞浓度并调整到同一浓度。各
蛋白[20]。组蛋白用8%SDS-PAGE分离蛋白,在冰水中电转
,将蛋白转模至PVDF膜,用BSA封闭液封
在PDB[21]数据库中关键蛋白的格式化学结构,闭1h后与一抗结合,放入4℃冰箱过夜,洗膜后与
下载为PDB格式。在PubChem[22]中下载粉防己碱二抗结合60min,再次洗膜后上机,最后获得的电泳
的化学结构,保存为SDF格式。利用Schrodinger软条带图[23]。

化,选择保留或删除链、水域和配体等,修复填充丢实验数据以xˉ±s表示。实验结果使用Graph-
失的侧链以及进行能量最小化。在ReviewandPadPrism8软件进行统计分析,多组建的比较采用
Modify选项中进行配体、水位置和电荷校正,在Re-单因素方差(One-WayANOVA)分析,P<
fine选项中进行最后蛋白结构的优化。通过Lig-差异有统计学意义。
Prep进行配体准备,加氢、去盐、中和带电基团、产2结果
生质子化状态最后产生互变异构结构。软件的Li-
gandDocking模块用于分子对接,通过结合能来评为了揭露矽肺差异基因表达情况,首先分析7
价药物与蛋白结构的亲和力,最后用pymol修饰例正常人和10例矽肺患者的肺实质的单细胞测序
表现。情况[11],共获得2065个差异基因,将数据标准化后
,分别筛选出上调和下调基因
用PBS清洗培养皿两遍后,用胰酶消化细胞,各100个。其次从GEO数据库中下载表达谱芯片
根据细胞状态不同选择合适的胰酶消化时间,胰酶数据GSE188520,其中包括了6只正常大鼠和6只
消化后吸取到15mL离心管中,离心5min,转速为二氧化硅诱导大鼠,共获得2291个差异基因,通过
5000r/min,离心后上清液倒掉,用PBS清洗再次R包的差异基因筛选,分别筛选出上调和下调基因
离心5min,转速为5000r/min。倒上清液后加1各100个。最后利用网络药理学通过Genecards、
mL培养液制备细胞悬液,准备计数,将细胞接种到CTD、OMIM数据库检索,共得到与矽肺疾病相关
96孔板,调整细胞浓度在5×103左右,每孔加入培803个基因,通过绘制UpSet图,获得交集基因129
养基100μL,每个样本重复3~5孔,在37℃培养箱个,上述基因被认为是与矽肺有密切联系的基因。
培养约6h后加入不同浓度的药物,放入培养箱24h见图1。:.

A、B:矽肺患者差异基因;C、D:二氧化硅滴注大鼠差异基因;E、F:数据库筛选基因
图1关键矽肺差异基因筛选
Fig1Screenofkeysilicosisdifferentialgenes
,G蛋白偶联受体结合、胶原
首先将正常人与矽肺患者的差异基因进行蛋白结合、生长因子结合、Wnt蛋白结合等分子功
KEGG通路富集分析,以P<,共筛选出能,活动纤毛、含胶原纤维的细胞外基质、基底膜等
13条KEGG通路,其中细胞外基质-受体相互作用细胞组分。其次对网络药理学数据库进行GO分
(ECM-receptorinteraction)与纤维化的形成有关。析,结果显示了2576个生物过程、66个细胞组分和
人瘤病毒感染(humanpapillomavirusinfection)与细142个分子功能,生物过程包括对脂多糖的反应、细
胞周期及凋亡有关,IL-17信号通路(IL-17signaling胞对生物刺激的反应、活性氧代谢过程、调节炎症
pathway)与细胞的生长、分化、炎症等有关。其次将反应等,分子功能包括细胞因子受体结合、蛋白质
网络药理学数据库的交集基因通路富集后共筛选丝氨酸/苏氨酸激酶活性、受体配体活性、G蛋白偶
出166条通路,主要的信号通路有AGE-RAGE信号联受体结合等,细胞组分包括囊泡腔、转录调节因
通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、受体因子相子复合物等,最后对矽肺大鼠的差异基因进行GO
互作用信号通路等。最后将矽肺大鼠的差异基因分析,包括Toll样受体信号通路、细胞对肿瘤坏死
进行通路富集后筛选出22条通路,主要有胃酸分因子反应、细胞对生物刺激反应等生物过程,糖***
泌、IL-17信号通路、疟疾、阿米巴病等信号通路有聚糖结合、G蛋白偶联受体结合、趋化因子活性等分
关,分析结果表明IL-17信号通路可能是影响矽肺子功能,细胞组分与上述两组细胞组分大体相同。
的关键通路。见图2。见图3。

通过R语言对矽肺患者的差异基因进行GO分PPI网络图中,靶基因用节点表示,靶点之间的
析,结果显示共有282个生物过程、33个细胞组分和连线代表基因之间的相互作用,将最低互动分数设
35个分子功能。其中主要结果包括纤毛运动、细胞置为最高置信度。将IL-17信号通路所包含的靶基
外基质组织、T细胞的活化、参与免疫反应中中性粒因导入STRING数据库,按照节点之间的交互分数:.

A、B:矽肺患者差异基因通路分析;C、D:网络数据库筛选基因通路分析;E:二氧化硅滴注大鼠差异基因通路分析
图2差异基因KEGG通路分析
Fig2AnalysisofdifferentialgeneKEGGpathway
由高到低进行排列,分数较高的靶基因大多与通路发挥关键作用,从而对早期矽肺产生影响。
MAPK信号通路有关,且这些靶点大多与炎症过程见图5。
有关,说明IL-
MAPK信号通路,
肺的发展。见图4。影响在巨噬细胞系THP-1中,随着药物浓度增
,粉防己碱抑制巨噬细胞增殖的能力逐渐增强,
将IL-17信号通路的关键蛋白与小分子化合物当药物浓度为5μmol/L时,细胞的凋亡率为20%,
粉防己碱进行分子对接,确定两者结合位置即活性当药物浓度为10μmol/L时,细胞的凋亡率为83%,
口袋大小,并显示出小分子和关键蛋白之间氢键作数据显示当加药浓度大于5μmol/L,细胞凋亡率明
用位置。对接亲和力分数通过薛定谔软件显增加,不适合用于细胞实验,在巨噬细胞中加药
(Schrödinger)计算得出。分子对接结果表明,粉防浓度设置为5μmol/L是最适浓度。在上皮细胞系
己碱与MAPK通路中的关键靶点RAF、ERK之间BEAS-2B中,随着药物浓度的增强,上皮细胞的凋
有良好的结合力。以上结果间接证明,粉防己碱可亡率呈线性增长趋势,在5μmol/L时,细胞的凋亡
能通过调控MAPK信号通路中的RAF/MEK/ERK率为5%,在10μmol/L时,细胞的凋亡率为16%。:.

A、B矽肺患者差异基因GO分析;C、D网络数据库筛选基因GO分析;E二氧化硅滴注小鼠差异基因GO分析
图3差异基因GO富集分析
Fig3GOenrichmentanalysisofdifferentialgene
根据对不同加药浓度时细胞凋亡率的计算,当加药上升(P<),与加硅组相比,粉防己碱组的
浓度为20μmol/L时,是效果最佳的浓度。见表1。TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-1α的表达明显下降(P<
-α、),其中TNF-α的表达量下降最为显著P<
TGF-β、IL-1β、IL-1α水平的影响TNF-)。与正常组相比,上皮细胞加硅组的TNF-α、
噬细胞和活化T细胞释放,不但可以刺激其他促纤TGF-β、IL-1β、IL-1α的表达均升高(P<),其中
维因子,还可以刺激TGF-β促进胶原的形成。IL-TNF-α的表达显著上升(P<),与加硅组相
1β、IL-1α可诱导吸附炎症细胞,调节其他炎症因子,比,加药组的TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-1α的表达明
促进成纤维细胞的增殖。利用PCR检测加硅组和显下降(P<)。见表2。
加药组中炎症因子的表达。与正常组相比,-Cadherin、N-Cad-
胞加硅组的TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-1α的表达均herin和Vimentin水平的影响上皮间质转化在矽
升高(P<),其中TNF-α和TGF-β的表达显著肺进展中起到重要作用,上皮细胞损伤可以导致转:.

图4IL-17信号通路蛋白互作图
Fig4IL-17signalingpathwayproteininteraction
A:粉防己碱与RAF蛋白虚拟对接;B:粉防己碱与ERK蛋白虚拟对接
图5粉防己碱与通路蛋白对接模式图
Fig5Dockingoftetrandrineandpathwayproteinpatterndiagram
表1粉防己碱对巨噬细胞和上皮细胞凋亡的影响(n=3,xˉ±s)化从而诱发肺纤维化,在转变的过程中,上皮细胞
Tab1Effectoftetrandrineonapoptosisofmacrophages标志物E-cadherin的表达降低,而间充质细胞标志
andepithelialcells(n=3,xˉ±s)
物N-cadherin和vimentin逐渐升高,使上皮细胞向
分组
细胞凋亡率(%)FP成纤维细胞转化。利用WB检测上皮间质转化相关
(μmol/L)
±,正常组相比,加硅组的E-Cadherin表达
±(P<)、N-Cadherin表达显著上升(P
<
±<)、Vimentin表达升高但并不显著。相较
±,加药组的E-Cadherin表达显著上升(P<
±)、N-Cadherin表达显著下降(P<)、Vi-
±
<

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