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·基础研究·
基于生物信息学的胃部“炎癌转化”过程中关键基因的
*
筛选及其作用*
袁蕴馨1,2**,付佳音2,莫非1,2***,何芸1***
(,贵州贵阳550004;,贵州贵阳550004)
[摘要]目的采用生物信息学分析方法,探讨胃部“炎癌转化”过程中潜在的关键基因。方法从公共基
因表达总库(GEO)中筛选与胃炎、胃癌前病变、胃癌相关的GSE130823、GSE55696的微阵列表达数据集,采用差
异分析工具(GEO2R)分析共有的差异表达基因(DEGs),采用注释、可视化综合发现数据库(DAVID)对DEGs进
行基因本体论(GO)分析及京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析,采用蛋白相互作用数据库(STRING)
和Cytoscape软件构建DEGs的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络,采用cytoHubba插件计算排名前10的
DEGs作为枢纽基因(Hub基因),采用生存曲线分析排名前5的Hub基因与胃癌患者生存情况的关系;收集15
例病理诊断为胃炎的胃组织、15例胃癌的癌组织及相应的癌旁组织,采用逆转录-实时荧光定量聚合酶链式反
应(qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹法(Westernblot)分别检测degree值排名前2的Hub基因的mRNA和蛋白质
水平进行验证。结果GSE130823、GSE55696分别筛选出DEGs312个和2493个,二者交集基因113个(其中
73个上调、40个下调);重叠DEGs在生物过程(BP)中主要富集于G蛋白偶联、蛋白质分解及细胞间连接等方
面,细胞组成(CC)变化的DEGs显著定位于细胞膜的有机组成部分、细胞基质及细胞外空间等区域,分子功能
(MF)变化的DEGs富集于序列特异性DNA结合、受体结合及分子结构活性等功能上,KEGG通路富集分析显
示DEGs主要富集于胃酸分泌、精氨酸和脯氨酸的代谢、细胞粘附和癌症中的转录失调等通路上;排名前10的
Hub基因为ATP4A、CLDN3、CLDN4、CLDN7、CXCL1、DEFA6、GCG、SI、CDH3及CLDN1,其中ATP4A、CLDN3、
CLDN4、CLDN7、CXCL1与胃癌患者的总体生存期(OS)密切相关;ATP4A在胃癌中表达下调,CLDN3在胃癌组织
中表达上调,与生物信息学分析结果符合。结论ATP4A、CLDN3与胃癌的发生发展密切相关,且ATP4A、
CLDN3、CLDN4、CLDN7、CXCL1均与患者的预后生存有关。
[关键词]胃炎;胃肿瘤;炎癌转化;生物信息学;关键基因筛选;生存分析
[中图分类号][文献标识码]A[文章编号]2096-8388(2022)05-0552-09
DOI:.2096-
Bioinformatics-basedscreeningofkeygenesandtheirrolesintheprocess
of"inflammation-to-cancertransformation"inthestomach
YUANYunxin1,2,FUJiayin2,MOFei1,2,HEYun1
(,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China;
,SchoolofClinicalLaboratoryScience,Guizhou
MedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)
[Abstract]ObjectiveToinvestigatethepotentialkeygenesbythebioinformaticsanalysisinthe
processof"inflammation-to-cancertransformation"
datasetsofGSE130823andGSE55696associatedwithgastritis,gastricprecancerandgastriccancer
werescreenedfromthepublicGeneExpressionOmnibus(GEO),andshareddifferentialgenes
(DEGs)wereanalyzedusingthedifferentialanalysistool(GEO2R),andDEGsweresubjectedto
geneontology(GO)analysisusingtheDatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery
(DAVID)analysisandKyotoEncyclopediaofGenesandGenomes(KEGG)enrichmentanalysis,
whileprotein-proteininteraction(PPI)networkofDEGswasconstructedusingtheproteininteraction
**[基金项目]贵州医科大学国家自然科学基金培育项目(gyfynsfc〔2020〕-1)
**贵州医科大学2019级硕士研究生
***通信作者E-mail:******@;******@
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5期袁蕴馨等基于生物信息学的胃部“炎癌转化”过程中关键基因的筛选及其作用
database(STRING)andCytoscapesoftware;Top10rankedDEGswerecalculatedashubgenes(Hub
genes)usingcytoHubbaplugin,andsurvivalcurveanalysiswasusedtotherelationshipbetweentop5
gastrictissueswithpathologicaldiagnosisofgastritisand15gastriccancertissues(including
paraneoplastictissues)werecollected,andtop2Hubgenesintermsofdegree-valueweredetectedby
reversetranscription-real-timequantitativefluorescencepolymerasechainreaction(qRT-PCR)and
proteinimmunoblotting(Westernblot),
andGSE55696,respectively,and113geneswereintersectedbyboth(73ofthemwereup-regulated
and40weredown-regulated).OverlappingDEGsweremainlyenrichedinbiologicalprocesses(BP)
inGproteincoupling,proteolysis,andintercellularjunctions;DEGswithchangesincellcomposition
(CC)weresignificantlylocatedintheorganiccomponentsofcellmembrane,cellmatrix,extracellular
spaceandotherregions;Differentialgeneswithmolecularfunction(MF)changeswereenrichedin
sequence-specificDNAbinding,receptorbinding,molecularstructureactivityandotherfunctions.
KEGGpathwayenrichmentanalysisrevealedthatoverlappingDEGsweremainlyenrichedinthe
pathwaysofgastricacidsecretion,arginineandprolinemetabolism,celladhesionandtranscriptional
,CLDN3,CLDN,CLDN7,CXCL1,
DEFA6,GCG,SI,CDH3andCLDN1;ATP4A,CLDN3,CLDN4,CLDN7,andCXCL1wereclosely
down-regulatedandCLDN3wasup-regulatedingastriccancertissues,whichwasinconformitywith
developmentofgastriccancer,andATP4A,CLDN3,CLDN4,CLDN7andCXCL1areallrelatedto
theprognosticsurvivalofpatients.
[Keywords]gastritis;gastriccancer;inflammation-to-cancertransformation;bioinformatics;key
genescreening;survivalanalysis
胃癌是全球常见的消化道恶性肿瘤之一,起源技术广泛用于疾病的检测,Li等[10]通过对基因芯
于胃黏膜上皮[1-2]。流行病学调查显示,胃癌发病片表达数据谱的分析,推测了胃癌的发生和发展在
率位居全球肿瘤发病率的第5位,每年全球有超过表观遗传学中的调节机制,明确枢纽(Hub)基因可
100万人诊断为胃癌,且病死率居全球第6,严重威作为胃癌诊断的生物标志物,并且具有一定的预后
胁人类的健康安全[3-4]。研究表明,慢性溃疡型结价值;Zhang等[11]通过综合分析5个与胃癌相关的
肠炎、结肠癌、幽门螺杆菌相关的慢性胃炎及胃癌数据表达谱,筛选出与胃癌相关的Hub基因。研
等疾病与长期的非可控性慢性炎症相关[5]。在慢究结果显示这些Hub基因在胃癌组织中高度表
性胃炎向胃癌进展的过程中,存在Correa经典级达,且其过表达与胃癌患者生存率低相关,但目前
联反应模式,即慢性非萎缩性胃炎→慢性萎缩性胃尚未有研究报道关键Hub基因在胃部“炎癌转化”
炎→肠上皮化生→异型增生或上皮内瘤变→肠型过程中的作用机制。因此,本研究旨在利用生物信
胃癌的进展趋势[6]。由于异型增生或上皮内瘤变息学分析,对“炎癌转化”发展过程进行系统的分
有较高的癌变风险,因此称该阶段为癌前病变[7]。子生物学研究,尤其是对驱动癌变各个阶段进展的
临床上常用的早期胃癌筛查手段,如血清标志物、分子事件进行分析,以挖掘非侵入性的潜在分子诊
胃蛋白酶等特异性较低,检出率不高,且因胃癌的断标志物,为延缓、阻断“炎癌转化”进程,提高胃
恶性程度高、侵袭性强,大多数病例诊断时已为晚癌早期诊断率提供新思路,并为探索“炎癌转化”
期[8-9]。尽管各项治疗手段已经取得了进展,但胃进展的分子机制提供依据。
癌的预后仍然较差,在全球的5年生存率低于
1材料与方法
30%[10]。随着高通量测序技术的高速发展,兴起
了以基因芯片表达数据谱为依据、
种层面开展研究的热潮[6]。目前,
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(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NC-当P<,|Log2FC|>1时差异有统计学意义;
BI)下的GEO数据库中,以胃炎、胃癌前病变和胃利用DrawVennDiagram(http://bioinformatics.
癌为关键词筛选出GSE130823、/)在线韦恩图绘制工
阵列数据集作为挖掘对象。GSE130823是由具,取2个数据集中重叠的DEGs。
Zhang等[11]利用Agilent公司的8ד炎
的数据,其实验平台为GPL17077,其中包括47例癌转化”过程当中所发挥的作用,使用注释、可视
胃炎对照组、17例胃低级别上皮内瘤变、14例胃高化综合发现数据库(thedatabaseforannotation,vi-
级别上皮内瘤变、16例胃肠癌;GSE55696是Xusualizationandintegrateddiscovery,DAVID;ht-
等[12]利用Agilent公司的4×44KG4112F芯片检tps:///)在线工具对交集DEGs
测的数据,其实验平台为GPL6480,其中包括19例从生物过程(biologicalprocess,BP)、细胞组成(cel-
慢性胃炎对照组、19例低级别上皮内瘤变、20例高lularcomponent,CC)及分子功能(molecularfunc-
级别上皮内瘤变及19例早期胃癌。tion,MF)3个角度进行基因本体论(geneontology,
—2022年2GO)分析及京都基因与基因组百科全书(Kyotoen-
月有明确病理诊断的胃炎和胃癌患者各15例,要cyclopediaofgenesandgenomes,KEGG)富集分析,
求符合:(1)所有患者皆签署知情同意书;(2)胃镜设置参数P<。
活检取材的样本直径>2mm;(3)(proteinproteininteraction,PPI)
实为胃炎及胃癌,且为初次诊断;(4)既往无癌症网络的构建将重叠DEGs导入交互式基因检索
史;(5)患者未接受过任何治疗(如激素治疗、靶向工具(searchtoolforrecurringinstancesofneighbour-
药物治疗或放疗等辅助治疗)。排除标准:(1)行inggenes,STRING)中进行蛋白质相互作用分析,
放疗化疗或全身治疗等辅助治疗的患者;(2)有源采用Cytoscape(/)软件将PPI
于其他肿瘤转移或者合并其他肿瘤可能的患者;网络可视化后,使用cytoHubba插件,以degree值
(3)有严重感染、凝血障碍及严重肺、肝、肾功能不为条件,从PPI网络中筛选出排名前10的模块,并
全的患者等。取胃炎患者胃炎部位的胃组织、胃癌将该模块中的基因作为后续研究对象。
患者的胃癌组织及癌旁组织作为研究标本。
(RIPAlysisPlotter(/)在线软件对
buffer,RIPA)裂解液、聚丙烯酰***凝胶电泳(poly-排名前5的Hub基因进行生存分析,评价其在胃癌
acrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE)凝胶制备患者中预后判断的价值。
试剂盒(上海爱必信生物),(1)采用逆转录-实时
(horseradishperoxidase,HRP)标记羊抗兔免疫球荧光定量聚合酶链式反应(quantitativeandreverse
蛋白G(immunoglobulinG,IgG)抗体、RNA提取液、transcriptionpolymerasechainreaction,qRT-PCR)验
Servicebio®RTFirstStrandcDNASynthesisKit(武证degree值排名靠前的2个Hub基因在胃炎、胃
汉赛维尔生物),兔抗人H,K-ATPase-α(ATP4A)抗癌组织及癌旁组织中的表达。TRIzol法提取胃炎
体(美国LSBio),HyPureTMMolecularBiologyGrade组织、胃癌组织及癌旁组织中总RNA,并使用Nano-
Water(美国HyClone),低温离心机(美国Beck-drop2000检测RNA浓度及纯度;使用Servicebio®
man),兔抗人紧密连接蛋白3(claudin3,CLDN3)抗RTFirstStrandcDNASynthesisKit将总RNA逆转
体、蛋白定量(bicinchoninicacidassay,BCA)检测试录为互补脱氧核糖核酸(complementaryDNA,
剂盒(沈阳万类生物),荧光定量聚合酶链式反应cDNA)后用于qRT-PCR,引物序列见表1;(2)
(polymerasechainreaction,PCR)仪(美国Bio-rad)。Westernblot验证degree值排名靠前的2个Hub基
、胃炎组织和胃癌组织中
(differentiallyexpressed的表达:使用RIPA裂解癌旁组织、胃炎组织及胃
genes,DEGs)的获取及分析使用差异分析工具癌组织,并提取总蛋白,采用BCA法对其进行蛋白
(geneexpressionomnibus2R,GEO2R)在线分析工定量并测定蛋白浓度;进行SDS-PAGE凝胶电泳,
具对GSE130823、GSE55696进行差异表达分析。,5%脱脂牛奶封闭
设置P值和差异倍数(foldchange,FC)筛选DEGs。2h,按照1∶1000的比例配制ATP4A一抗稀释液,
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5期袁蕴馨等基于生物信息学的胃部“炎癌转化”过程中关键基因的筛选及其作用
1∶500的比例配制CLDN3一抗稀释液,
孵育盒中,于4℃孵育过夜,,组间比较
(TBSwithtween-20,TBST)漂洗后放于封闭液中,采用t检验,用Kaplan-MeierPlotter数据库分析
室温震荡封闭2h;TBST洗膜3次,二抗于室温下Hub基因与胃癌患者预后的关系,P<
孵育1h;TBST洗膜3次,曝光。异有统计学意义。
表1引物序列2结果
基因名称引物序列PCR产物/
ATP4A上游:GATACCCTTCAACTCCACCAACA263使用Sangbox软件对GSE130823、GSE55696进
下游:GCGGGTAGTCCTTCTCATTCA行标准化处理(图1)。利用GEO2R在线分析工具
CLDN3上游:TGGTCGGCCAACACCATTAT169结果表明,GSE130823筛选出差异表达基因312个,
下游:CCGTGTACTTCTTCTCGCGTGSE55696筛选出差异表达基因2493个,二者交集
GAPDH上游:GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC168
基因有113个,其中73个上调,40个下调(图2)。
下游:TGATGACCCTTTTGGCTCCC
注:A、B分别为GSE130823标准化前、后数据,C、D分别为GSE55696标准化前、后数据;
蓝色表示标准化前的数据分布,红色表示标准化后的数据分布。
图1GSE130823及GSE55696微阵列数据集的标准化处理
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proteincoupledreceptorsignalingpathway)、蛋白质
分解(proteolysis)、细胞间连接(celladhesion)等方
面。CC变化的DEGs显著定位在细胞膜的有机组
成部分(extracellularspace)、细胞基质(plasma
membrane)、细胞外空间(integralcomponentof
membrane)等区域;MF变化的差异基因富集在序
列特异性DNA结合(sequence-specificdouble-stran-
dedDNAbinding)、受体结合(receptorbinding)、分
子结构活性(structuralmoleculeactivity)等功能上
注:蓝色表示GSE55696数据集,红色表示GSE130823数据集,(图3)。KEGG通路富集分析显示DEGs主要富集
红蓝色交接处表示重叠DEGs。在:(1)胃酸分泌(gastricacidsecretion);(2)精氨
图2重叠DEGs筛选结果酸和脯氨酸代谢(arginineandprolinemetabolism);
(3)蛋白质的消化与吸收(proteindigestionandab-
sorption);(4)细胞粘附(celladhesion)等通路上
(图4)。
BP变化的DEGs主要富集在G蛋白偶联(G-
注:绿色表示BP,橙色表示CC,蓝色表示MF;红色框线表示文中已说明的内容。
图3重叠DEGs的GO富集结果
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注:红色、粉色、橙色、浅橙色、黄色及浅米色分别表示degree
注:颜色越深表示差异越显著。值排名第1、2、3、4、5及6的DEGs;颜色越深排名越靠前。
图4重叠DEGs的KEGG富集结果图6重叠DEGs中Hub基因的筛选
overlappingDEGs
-MeierPlotter数据库对Hub基因中de-
构建113个重叠DEGs的PPI网络,共包含48gree值排名前5的基因进行生存分析,结果表明
个节点和76条边(图5);使用cytoHubba插件,按ATP4A、CLDN3、CLDN4、CLDN7、CXCL1均与胃癌
degree值筛选出排名前10的DEGs,为Hub基因,患者的总体生存期(overallsurvival,OS)相关
包括ATPase-H+/K+exchanging-alphapolypeptide(P<,图7)。
(ATP4A)、claudin3(CLDN3)、claudin4(CLDN4)、
claudin7(CLDN7)、ChemokineC-X-Cmotifligand1对Hub基因中degree值排名前2位的ATP4A
(CXCL1)、Defensin-alpha6-Panethcell-specific(DE-与CLDN3进行临床样本验证,Westernblot和qRT-
FA6)、Glucagon(GCG)、Sucrase-isomaltase(SI)、Cad-PCR结果显示,与癌旁组织相比,ATP4A在胃炎组
herin3(CDH3)、claudin1(CLDN1),用于后续分析织中表达下调,CLDN3在胃炎组织中表达上调;与
(图6)。胃炎组织相比,ATP4A在胃癌组织中表达下调,
CLDN3在胃癌组织中表达上调(P<,图8)。
3讨论
1863年,Rudolf等首先提出癌症起源于炎症
部位[13]。19世纪,Virchow首次提出“炎癌转化”
的构想,并指出“炎癌转化”是炎症疾病从“炎症-
癌前病变-癌症”整个动态过程的总称[14]。有研
究指出,非可控性炎症可诱导肿瘤的发生和发展,
作为非可控炎症向癌症恶性转化的经典模式,胃部
“炎癌转化”已成为近几年的研究热点[15]。
近年来,生物信息学在各种疾病的研究中得到
了广泛的应用,特别是利用GEO数据库筛选潜在
图5重叠DEGs的PPI网络
,这些芯片数据集的充分利用,为生命科
学研究提供了宽广的发展前景[16]。本研究通过生
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注:A为ATP4A,B为CLDN3,C为CLDN4,D为CLDN7,E为CXCL1。
图7Hub基因生存分析
注:A为ATP4A、CLDN3的Westernblot检测结果,B、C为ATP4A、CLDN3蛋白定量的结果;D、E为qRT-PCR检测
ATP4A、CLDN3mRNA水平的qRT-PCR检测结果;(1)与癌旁组织比较,P<;(2)与胃炎组织比较,P<。
图8ATP4A、CLDN3蛋白及mRNA的表达
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物信息学及高通量测序技术,筛选了2个高质量的及胃黏膜肠上皮化生细胞中的表达明显高于正常
表达谱数据集,初步鉴定了113个DEGs;通过DA-胃粘膜细胞。此外,Wu等[27]发现,CLDN7在胃癌
VID数据库对2个芯片数据集中重叠的DEGs进中过表达,能促进胃癌细胞的增殖、侵袭。因此,
行GO与KEGG富集分析,富集分析表明DEGs富TJs的表达在胃癌细胞中存在异常,有可能为早期
集的GO条目主要有G蛋白偶联受体信号通路、蛋胃癌的诊断、预后等提供新的分子生物学标志物,
白水解、细胞粘附等方面,这些基因还介导控制细具有一定的临床研究价值。
胞分化、增殖和凋亡等过程;KEGG通路富集分析趋化因子是一种由肿瘤细胞和基质细胞产生
显示DEGs主要参与胃酸分泌、精氨酸和脯氨酸代的小分子分泌蛋白,和其相配对的同源受体结合可
谢、蛋白质的消化与吸收等通路,提示重叠DEGs通过直接或间接的方式调控肿瘤的生长,包括激活
可能通过这些生物途径参与胃炎-胃癌“炎癌转信号通路,直接调控肿瘤细胞的增殖与转移。其
化”的过程。此外,为挖掘DEGs相互之间的关联,中,趋化因子CXC亚家族在胃癌细胞的增殖、侵袭
本研究使用Cytoscape软件对重叠DEGs进行进一及转移过程中具有促进作用;CXCL1在巨噬细胞
步的分析,按照degree值进行筛选,得到了前10个和中性粒细胞中均有表达,可参与炎症、创伤愈合
最有可能参与“炎癌转化”进程的Hub基因,并通等过程,与胃癌的不良预后呈正相关[