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JournalofHainanMedicalUniversity1299
DOI:.
网络出版地址:.
山奈酚抑制软骨凋亡延缓小鼠膝骨关节炎的实验研究
米倚林,易南星,许晓彤,杨烙坚,李佳宾,陈树源,邝高艳,卢敏
(湖南中医药大学第一附属医院,湖南长沙410007)
[摘要]目的:研究山奈酚通过抑制软骨凋亡干预小鼠膝骨关节炎(kneeosteoarthritis,KOA)的疗效机
制。方法:首先,借助TCMSP检索山奈酚的靶基因;采用GeneCards、OMIM等数据库获得KOA的疾病靶
点,并进行GO富集分析和KEGG信号通路分析。然后,将18只C57雄性小鼠随机分为假手术组、模型组和
山奈酚组,采用内侧半月板失稳手术诱导小鼠KOA模型,山奈酚组以50mg/kg剂量灌胃一次,假手术组和
模型组每日予以等量生理盐水,持续8周。结果:检索发现山奈酚有63个靶基因,与KOA共有靶基因35个。
GO分析和KEGG通路分析发现,共同靶点与外源性凋亡信号通路、氧化应激反应等生物学过程,以及细胞
凋亡、肿瘤坏死因子调控等信号通路密切相关。分子对接实验发现山奈酚与BCL-2、BAX、CASP3等靶点
有良好的结合性。膝关节番红O-固绿染色结果表明,与模型组比较,山奈酚组膝关节软骨病理改变明显减
轻,OARSI评分明显改善(P<),软骨面积明显增加(P<)。Westernblot发现山奈酚显著降低膝
关节软骨中BAX、CASP3的蛋白表达(P<~),且升高BCL-2蛋白表达(P<)。结论:山奈酚治
疗KOA具有多靶点-多通路的特点,可通过调控BCL-2、BAX、CASP3等关键基因延缓KOA,其作用机制与
抑制软骨凋亡相关。
[关键词]山奈酚;膝骨关节炎;细胞凋亡;实验研究;网络药理学;分子对接
[中图分类号][文献标识码]A[文章编号]1007-1237(2022)17-1299-08
Kaempferolattenuateskneeosteoarthritisviainhibitingcartilageapoptosisinmice
MIYi-lin,YINan-xing,XUXiao-tong,YANGLuo-jian,LIJia-bin,CHENShu-yuan,KUANGGao-yan,LUMin
(TheFirstAffiliatedHospitalofHunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410007,China)
[FoundationProject]:ThisstudywassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(81874476),NationalKeyR&D
Project(2018YFC2002500),HunanNaturalScienceFoundationProject(2018JJ2303,2019JJ50462,2020JJ5422),InnovationProject
ofHunanScienceandTechnologyDepartment(2017SK50302),ProjectofHunanAdministrationofTraditionalChineseMedicine
(2015165),HunanHealthCommissionProject(202104070364),GraduateStudentInnovationProjectofHunanUniversityofChinese
Medicine(2021CX71)andConstructionProjectofFirst-ClassDisciplineofTraditionalChineseMedicineinHunanUniversityofChinese
Medicine(2021ZYX32)
[Author]:MIYi-lin,E-mail:******@.
[Correspondenceto]:LUMin,.,Professor,DoctoralSupervisor,ChiefPhysician,E-mail:******@;KUANGGao-
yan,Postdoctor,AssociateChiefPhysician,E-mail:******@.
Received:2022‑⁃‐03‑⁃‐09Revised:2022‑⁃‐04‑⁃‐07JHMU,2022;28(17):1299‐⁃‑1306
Viewfromspecialist:Itiscreative,andofcertainscientificandeducationalvalue.
[ABSTRACT]Objective:Tostudythemechanismofkaempferolintheinterventionofkneeosteoarthritis(KOA)inmiceby
:Firstly,thetargetgenesofkaempferolwereretrievedviaTCMSP,andthegenesrelated
toKOAwereobtainedbyGeneCards,OMIM,PharmGKB,TTD,
,18maleC57micewererandomlydividedintotheshamop‐⁃‑
[基金项目]国家自然科学基金项目(81874476);国家重点研发计划项目(2018YFC2002500);湖南省自然科学基金项目(2018JJ2303,
2019JJ50462,2020JJ5422);湖南省科技厅创新项目(2017SK50302);湖南省中医药管理局项目(2015165);湖南省卫生健康委项目
(202104070364);湖南中医药大学校级研究生创新课题(2021CX71);湖南中医药大学中医学一流学科建设课题(2021ZYX32)
[作者简介]米倚林,E-mail:******@。
[通讯作者]卢敏,硕士,教授,博士生导师,主任医师,E-mail:******@;邝高艳,博士后,副主任医师,E-mail:******@126.
com。
[收稿日期]2022-03-09[修回日期]2022-04-07网络出版时间:2022-04-1112:39:57

erationgroup,themodelgroup,andthekaempferolgroup(50mg/kg).Exceptfortheshamoperationgroup,theKOAmouse

amountofnormalsalinedailyfor8weekswhilethekaempferolgroupwasgiven50mg/:A

thatbiologicalprocessessuchasextrinsicapoptoticsignalingpathwayandresponsetooxidativestress,aswellassignalingpath‐⁃‑

showedkaempferolhasgoodbindingpropertieswithpredictedtargetsBcl-2,BAX,
group,thepathologicalchangesofcartilageinthekaempferolgroupweresignificantlyreduced,OARSIscoresweresignificantly
decreased(P<),andcartilageareawasincreased(P<).Inaddition,Westernblotanalysisshowedthatkaempferol
significantlydecreasedtheproteinexpressionofBAXandCASP3(P<,P<),andincreasedtheproteinexpressionof
BCL-2(P<).Conclusion:ThetreatmentofKOAwithkaempferolhasthecharacteristicsofmulti-targetandmulti-pathway,
andthemechanismmayberelatedtotheregulationofkeygenessuchasBcl-2,BAX,andCASP3toinhibitcartilageapoptosis.
[KEYWORDS]Kaempferol;Kneeosteoarthritis;Apoptosis;Invivostudy;Networkpharmacology;Moleculardocking
膝骨关节炎(kneeosteoarthritis,KOA)/)对山奈酚相关靶点进行统一
的关节慢性退行性疾病,主要表现为关节软骨退转化。
变、软骨下骨硬化和滑膜炎症[1]。
和肥胖人口的增加,KOA的患病率正在上升,已成以“kneeosteoarthritis”为检索和筛选KOA相
为中国乃至世界面临的重要社会健康问题[2]。临床关靶基因的关键词,通过GeneCards数据库
主要以非甾体抗炎药(NSAIDs)缓解KOA症状。(/)、OMIM数据库
目前尚缺乏能够有效治疗KOA的药物,晚期的关(/)、PharmGKB数据库(https://
节置换是唯一的治疗方式[3]。因此,)、TTD数据库(http://db.
KOA的药物。/)、Drugbank数据库(https://www.
中药是药物研究的宝库,/)得到KOA相关靶基因。合并5个疾
理分析结果和实验验证结合的方法探究山奈酚对病数据库靶点,删除重复基因得到与KOA相关的
KOA的作用。已有研究表明多酚可能有益于骨关靶基因。
节炎,而黄***类化合物是多酚家族的主要成员[4]。-KOA网络构建
山奈酚是一种生物黄***类化合物,广泛存在于杜基于筛选出的山奈酚潜在靶点,借助Cyto‐⁃‑
仲、牛膝、独活等中药中。。
凋亡、抗炎和抗氧化等多种药理活性[5]。有文献证Venn工具包绘制山奈酚与KOA相关靶点Venn图,
明山奈酚可通过抑制NF-κB通路减轻IL-1β诱导的取其交集,得到共同靶点,
软骨细胞炎症[6];也能够抑制MAPK相关的ERK和建山奈酚与KOA的共有靶点网络图。
p38信号通路及IL-
产生[7]。为进一步了解得到的交集网络在基因功能和
网络药理学是基于生物信息学和系统生物学相关信号通路上的具体作用,
发展起来的新型学科,为揭示中药复杂机理的研究(/)数据库对筛选出的靶点
提供了新的方法[8]。本研究通过网络药理学探讨山蛋白进行GO功能富集分析与KEGG通路富集分析
奈酚治疗KOA的分子机制,借助分子对接验证山(),
奈酚与其干预KOA的关键靶基因(BCL-2、
CASP3)的结合情况,并结合体内实验验证山奈酚包对富集分析结果及通路进行可视化处理。

通路相关基因表达的影响。为进一步了解山奈酚和所筛选体内受体靶点
1材料与方法的结合模式和亲和力,进入PubChem数据平台
(,gov/)下载山奈酚
借助中药系统药理数据库和分析平台TCMSP的2D结构,
()得到山奈酚药物结构优化并转换为3D结构。利用RCSB数据平台
作用靶点,利用蛋白标准化Uniprot数据库(https://(/)下载靶点蛋白的3DPDB

格式文件;,4%多聚甲醛固定;
%EDTA脱钙4周,组织脱水,石腊包埋,5µm矢
软件对关键靶点进行加氢、计算电荷等处理。并加状位连续切片,进行番红O-固绿染色,并用国际骨
极性氢,加载电荷,构建活性口袋;(osteoarthritisresearchsocietyinter‐⁃‑
件将目标靶点与山奈酚进行分子对接,以结合能作national,OARSI)评分系统分析软骨退变程度[11],利

为对接评价指标,导入软件进行可视用Image-。
化处理。
KOA
-2、BAX、CASP3蛋白水平。将软骨
SPF8C57BL
,研磨10~15min,在冰上
18
性小鼠只,由湖南中医药大学动物实验中心提搅拌30min收集上清。BCA法测定蛋白浓度,经凝
供。将小鼠随机分为假手术组、模型组、山奈酚组。胶电泳转膜封闭后,孵育相应一抗和二抗,显影并
各组小鼠在相同条件下自由饮水、摄食,由湖南中采集图像。
医药大学实验动物中心饲养。本实验方案由湖南

中医药大学伦理委员会审核(伦理编号:LL2020
,结
121601)。
果采用均数±标准差(xˉ±s)表示。满足正态分布,
,2%
且方差齐时用单因素方差分析(one-wayANO‐⁃‑
***麻醉小鼠,右侧膝关节脱毛膏脱毛,碘伏消
VA);当方差不齐时,采用Dunnett'sT3检验。不满
毒小鼠膝关节部位,半月板内侧失稳手术(destabili‐⁃‑
足正态分布时,则采用非参数检验;两两比较采用
zationofthemedialmeniscus,DMM)手术诱导KOA
LSD法。P<。
模型[9]。模型组:右膝关节内侧髌韧带与内侧副韧
2结果
,显微镜下用显微剪切断内侧

半月板胫骨韧带,缝合皮肤切口;假手术组:行假手
TCMSP数据库发现山奈酚共有作用靶点63个,
术造模,在右膝关节内侧髌韧带与内侧副韧带中间
包括BAX、PTGS2、MMP1等,见图1A。检索Gene‐⁃‑
,缝合皮肤切口。伤口处碘伏擦拭,
Cards、OMIM、PharmGKB、TTD、Drugbank5个疾病
放回笼内,等待小鼠苏醒。山奈酚组每日予以50
基因相关数据库,共得到与KOA疾病发生密切相关
mg/kg山奈酚灌胃[10],假手术组和模型组每日予以
的1637个靶基因。其中,GeneCards1579个、
同体积生理盐水灌胃;持续8周。
OMIM6PharmGKB9TTD2Drugbank
、试剂、仪器山奈酚(纯度≥%,个、个、个、
715Venn1B
HPLC分析,江苏永健医药科技有限公司),脱毛膏个,将个数据库的结果绘制图,如图所
63KOA
(利洁时公司,印度),***气体麻醉剂(瑞沃德,示。将上述筛选得到的山奈酚个靶点与疾
163735
),多聚甲醛(国药试剂有限公病相关的个靶点取交集,得到个共同靶点,
BCL2BAXCASP31C
司,80096618),无水乙醇(国药试剂有限公司,其中包括、、等,如图所示。
GOKEGG
10009218),番红O-固绿染液(
限公司,生产批号DB0082),氨水(
司,10002118),二甲苯(国药试剂有限公司,关靶点进行信号通路与生物学过程(biologicalpro‐⁃‑
10023418),氢氧化钠(General-Reagent,G19852cess,BP)、细胞组分(cellcomponent,CC)和分子功
H),世泰组织包埋盒(江苏世泰实验器材有限公司,能(molecularfunctions,MF)富集分析,并利用
REF31050102W),世泰黏附载玻片(。结果显示:山奈酚主要
器材有限公司)。全蛋白提取试剂盒(南京建成),参与的生物学过程包括外源性凋亡信号通路(extrin‐⁃‑
BCA蛋白浓度检测试剂盒(南京建成),兔抗小鼠sicapoptoticsignalingpathway)、凋亡信号通路的负
CASP3、BAX、BCL-2抗体(Abcam,1∶500),HRP调控(negativeregulationofapoptoticsignalingpath‐⁃‑
标记的山羊抗兔二抗IgG(CST,1∶1000),小动物way)、氧化应激反应(responsetooxidativestress)
麻醉机(MatrxVMR美国),脱水机(LEICA,等,见图2A。参与的通路主要有细胞凋亡(apopto‐⁃‑
TP1020),包埋机(LEICA,EG1150C)等。sis)、肿瘤坏死因子信号通路(TNFsignalingpath‐⁃‑
8
)等,见图2B。
用小动物呼吸麻醉机,2%***深度麻醉小鼠后

AB
C
A:KOA疾病相关基因合并Venn图;B:山奈酚‐⁃‑靶基因网络图;C:山奈酚与KOA共同靶基因网络图
图1山奈酚治疗KOA的潜在靶点网路图
Fig1NetworkofpotentialtargetsforthetreatmentofKOAwithkaempferol
A:山奈酚治疗KOA的GO数据分析气泡图;B:山奈酚治疗KOA的KEGG富集分析气泡图
图2山奈酚-KOA靶点与通路的KEGG与GO富集分析
Fig2GOanalysisandKEGGpathwayenrichmentanalysisofkaempferol-KOA
-2、BAX、CASP3对接良好点(BCL-2、BAX、CASP3)进行结合能预测。根据
通过分子对接来评估蛋白质与配体的结合潜参考文献[12]表明配体与受体的结合能力为−
能以进一步了解药物与所筛选作用靶点的相关性。kcal/mol具有明显结合活性,−
,−。结

果表示,3个靶点均存在较好结合能力,山奈酚与能力为−,结合活性明显。将山奈酚与
BCL-2受体结合能力为−,与BAX受BCL-2、BAX、CASP3的对接结果导入PYMOL
体结合能力为−,,如图3所示。
图3山奈酚与BCL-2、BAX、CASP3的分子对接图
Fig3Visualizationofkaempferol-targets(BCL-2,BAX,CASP3)docking
(±)显著升高(P<),胫骨软骨面
通过番红O-固绿染色发现,假手术组小鼠积[(±)mm2]显著减少(P<
膝关节关节软骨完整,软骨表面光滑,)。山奈酚干预后,与模型组比较,山奈酚
缺损,半月板完整,无明显病理表现。模型组与组小鼠关节软骨OARSI评分(±)明显
山奈酚组胫骨侧关节软骨厚度明显降低,软骨改善(P<),软骨面积[(±)
面粗糙、缺损。统计分析发现,与假手术组比mm2]较模型组明显增加(P<)。如图4
较,模型组小鼠膝关节关节软骨OARSI评分所示。
F:股骨,T:胫骨,M:半月板。***P<,**P<。
图4小鼠膝关节番红O-固绿染色(40×,200×)、OARSI评分和软骨面积
Fig4MicekneejointsstainedwithsafraninO-fastgreenanddeterminationofOARSIscoreandcartilagearea

-2、BAX、CASP3蛋白则显著降低[(±),(P<)];经山奈酚
表达干预,小鼠软骨BAX、CASP3蛋白表达量显著降低
Westernblot检测发现,模型组小鼠膝关节软骨[(±),(±)(P<~)],而
中BAX、CASP3蛋白表达量[(±),BCL-2蛋白表达则显著升高[(±),P<
(±)]较假手术组[(±),(±]。表明山奈酚对软骨细胞凋亡具有显著抑制
)]显著升高(P<~),而BCL-2表达作用,见图5。
***P<,**P<,*P<
图5小鼠膝关节软骨的BAX、BCL-2、CASP3表达
Fig5BAX,BCL-2andCASP3proteinexpressionbyWesternblotassay
3讨论现山奈酚可通过调节软骨细胞XIST/miR-130a/
KOA是中老年人常见的关节疾病,不仅可以导STAT3轴抑制炎症和细胞外基质降解[21]。也有临
致关节疼痛、畸形和功能障碍,还可显著升高心血床试验证实山奈酚在减轻KOA疼痛和症状方面疗
管事件、下肢深静脉血栓栓塞、髋部骨折以及全因效显著[22]。网络药理学作为药物研究的一种方法,
死亡率的风险[13]。中华医学会骨科学分会[13]、国际融合了药理学和生物学的多重优势,以药物-成分-
骨关节炎研究协会(OARSI)[14]等均推荐首选基础靶点-通路的网络模式为特点,为药物与疾病之间的
治疗。本研究拟寻求治疗KOA的潜力药物,山奈联系提供研究方法,并能反映药物多靶点、多通路
酚是一种广泛存在于天然药品中的黄***醇,被证实的作用关系[8]。本研究通过网络药理学方法阐述山
是重要的天然抗炎化合物之一,在关节炎、癌症、心奈酚治疗KOA的作用机制。笔者通过挖掘山奈酚
血管等疾病中均发挥改善病情的作用,这与其降低和KOA疾病发生、发展密切相关的靶基因,并构建
炎症相关疾病的风险密切相关[15,16]。山奈酚广泛存了山奈酚与KOA之间靶基因的网络关系,发现
在于多种中草药和复方制剂中,已有报道说明山奈BCL2、BAX、CASP3、NOS2和JUN等是山奈酚干
酚等黄***醇类化合物是经典名方独活寄生汤的有预KOA的重要靶点。通过GO和KEGG富集分析,
效化学成分之一,独活寄生汤多年来广泛应用于临山奈酚参与外源性凋亡信号通路、凋亡信号通路的
床治疗KOA等骨科疾病,并且取得了较好疗效[17]。负调控和氧化应激反应等生物学过程干预KOA,且
本课题组前期已证实加味独活寄生合剂含药血清与细胞凋亡、肿瘤坏死因子信号通路等通路有关。
能通过调控Wnt信号通路改善IL-1β诱导的软骨细细胞凋亡是一种受基因调控的程序性细胞死亡方
胞病理表现[18],并且该药可以通过降低OA患者关式[23],对软骨发育和维持适当的动态平衡至关重
节液中IL-1,TNF-α及NO水平改善关节功能及疼要[24]。软骨退变是KOA的关键特征,许多实验研
痛[19]。本研究首次系统地阐述了山奈酚通过调控究均表明软骨细胞凋亡在KOA的进展中起着关键
BAX、BCL-2、CASP3干预KOA的作用机制。作用[25]。在KOA病程中,软骨细胞在多种原因导
作为天然食品药品的化学活性成分,山奈酚的致的炎症微环境刺激下发生凋亡,导致软骨功能受
副作用较小而作用广泛,受到了越来越多的关注,损[26]。因此,抑制软骨细胞凋亡可作为治疗KOA
此前已有多项研究证实山奈酚对KOA有积极作的重要方法。细胞凋亡机制非常复杂,与一系列的
用。已有研究发现山奈酚通过调控NF-κB和信号分子相关,其中BCL-2、BAX和CASP3是细胞
MAPK通路表现出很强的抗炎和抗关节炎作用[6,7]。凋亡通路中3个关键的分子[27]。本实验分子对接验
此外,Jiang等[20]的研究发现山奈酚可能通过下调证了山奈酚与BCL-2、BAX和CASP3的结合能力,
miR-146a、抑制Decorin的表达而干预脂多糖诱导发现其不仅具有明显的结合能力,而且结合活
的软骨ATDC5细胞凋亡和炎症反应。近期研究发性强。

Caspase家族作为细胞凋亡的核心,最早发现396(10264):1711-1712.
于1985年[28],根据其结构和功能可分为启动型和执3KatzJN,ArantKR,‐⁃‑
行型,其中启动型Caspases可以激活执行型mentofhipandkneeosteoarthritis:Areview[J].JA‐⁃‑
MA202**********.
CASP3,放大凋亡信号通路,激活的CASP3可触发,,():-
4ShenCL,SmithBJ,LoDF,