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202274413 HebeiMedicalJournal,2022,
.1002-
:··
槐定碱上调表达抑制宫颈癌
miR-5195-3pHeLa
细胞增殖迁移和侵袭的机制研究
、
李刚张达张建秀
【摘要】目的探讨槐定碱对宫颈癌细胞生物学行为的影响及分子机制。方法将宫颈癌细胞随
HeLa HeLa
机分为对照组、槐定碱低、中、高浓度组、组、组、槐定碱组、槐定碱
miR-5195-3pmiR-NC+anti-miR-5195-3p+anti-miR-
组;四***偶氮唑盐比色法()检测细胞增殖抑制率;克隆形成实验检测细胞克隆形成数;划痕实验检测细胞
NCMTT
划痕愈合率;小室法检测细胞侵袭;法检测蛋白表达;实时荧光定量()检测
TranswellWesternblotPCRRT-qPCRmiR-
表达水平。结果与对照组比较,槐定碱低、中、高浓度组细胞增殖抑制率、蛋白表达、
5195-3p HeLaE-cadherinmiR-
表达升高,细胞克隆形成数、划痕愈合率、侵袭细胞数、蛋白表达减少,呈浓度依赖性(P)。
5195-3pN-cadherin<
过表达后,细胞增殖抑制率、蛋白表达升高,划痕愈合率、蛋白表达降低,细胞
miR-5195-3pHeLaE-cadherinN-cadherin
克隆形成数和侵袭细胞数减少(P)。干扰表达逆转了槐定碱对细胞增殖、迁移和侵袭的作
<-5195-3pHeLa
用。结论槐定碱通过上调表达抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭。
miR-5195-3pHeLa
【关键词】槐定碱;;宫颈癌;增殖;迁移;侵袭
miR-5195-3p
【中图分类号】【文献标识码】【文章编号】()
A 1002-7386202213-2003-04
Mechanismofsophoridineinhibitingtheproliferation,migrationandinvasionofcervicalcancerHeLacellsbyup-
regulatingtheexpressionofmiRpLIGang∗,ZHANGDa,ZHANGJianxiu.∗DepartmentofBloodTransfusion,
51953
LuzhongHospitalofPKUCare,Shandong,Zibo,China
255400
【Abstract】Objective
ToexploretheeffectsofsophoridineonthebiologicalbehaviourofcervicalcancerHeLacells
Methods,,,
anditsmolecularmechanism. HeLacellswererandomlydividedintocontrolgrouplow-dosemedium-doseand
,,,
high-dosesophoridinegroupsmiR-5195-3pgroupmiRNCgroupsophoridine+antimiR-5195-3pgroupandsophoridine+
();
anti-miR-
;;
andcloneformationtestdetectedthecellcloneformationnumberscratchtestdetectedthescratchhealingrateofthecells
;;
TranswellmethoddetectedthecellinvasionWesternBlotdetectedtheproteinexpressionReal-timefluorescentquantitative
()Results,
PCRRTqPCRmeasuredtheexpressionlevelofmiR51953p. ComparedwiththoseincontrolgroupthetheHeLa
,,,
cellproliferationinhibitionrateandexpressionlevelsofE-cadherinproteinandmiR-5195-3pinlow-dosemedium-dose
,,,,
high-dosesophoridinegroupsweresignificantlyincreasedhoweverthecellcloneformationnumbersscratchhealingrate
,
invasioncellsnumbersandexpressionlevelsofN-cadherinproteinweresignificantlydecreasedwithaconcentrationdependent
(P),,
manner<-5195-3ptheHeLacellproliferationinhibitionrateE-cadherinprotein
,,,,
expressionlevelsweresignificantlyincreasedhoweverthescratchhealingrateexpressionlevelsofN-cadherinproteincell
(P)
cloneformationnumbersandinvasioncellsnumbersweresignificantlydecreased<
,Conclusion
miR-5195-3preversedtheeffectsofsophoridineontheproliferationmigrationandinvasionofHeLacells.
,
SophoridinecaninhibittheproliferationmigrationandinvasionofHeLacellsbyup-regulatingtheexpressionlevelsofmiR-
5195-3p.
【Keywords】;;;;;
sophoridinemiR-5195-3pcervicalcancerproliferationmigrationinvasion
宫颈癌是威胁女性健康的第二大癌症放射及化单体生物碱具有显著的抗肿瘤作用是一种高效低毒
,,,
学治疗的不良反应较大中药有效成分在抗肿瘤方面的抗癌生物碱有研究报道槐定碱联合顺铂可以有效
,;
有着多途径多靶点毒副作用小等优势一定程度上抑制卵巢癌细胞增殖降低其恶性程度[3]槐定碱可
、、,,。
可延长宫颈癌患者的生存期[1,2]因此开发可用于抑制肝癌细胞增殖和促进凋亡[4]槐定
。,SMMC-7721。
抗宫颈癌中药对其治疗具有重要意义槐定碱是从豆碱可抑制肺癌细胞体外增殖和侵袭能力[5]槐
。A549。
科槐属植物苦豆子中提取的定碱通过靶向促进细胞自噬凋亡和周期
(sophoraalopecuroidesL)MAPKAPK2、
阻滞从而抑制结直肠癌的发生与发展[6]然而槐定
,。
作者单位山东省淄博市北大医疗鲁中医院输血科李碱对宫颈癌细胞生物学行为的影响及机制尚不
:255400 ,(HeLa
刚山东省淄博市妇幼保健院保健部张达山东省淄博市第一医院清楚有研究报道可能通过阻碍
);();。miR-5195-3pEMT
门诊部张建秀通路抑制宫颈癌细胞的增殖迁移与侵袭[7]
()SiHa,。
河北医药年月第卷第期
2004202274413 HebeiMedicalJournal,2022,
对神经胶质瘤细胞亦具有增殖抑制作下随机选择个视野观察并计数
miR-5195-3p(×200)5,。
用[8]因此本实验旨在探讨槐定碱对宫颈癌法检测蛋白表达提取各组细胞总
。, Westernblot
细胞增殖迁移和侵袭的影响及机制是否与蛋白煮沸使蛋白变性按照上样进行聚
、miR-5195-,5min,40μg
有关丙烯酰***凝胶电泳然后湿转到膜用封闭液封闭
3p。,NC,
材料与方法分别加入抗体
1 1h,E-cadherin、N-cadherin(1∶1000),
材料宫颈癌细胞株上海冠导生物工程孵育过夜洗膜加入山羊抗兔
HeLa(4℃;,IgG-HRP(1∶2000)
有限公司培养基浙江联硕生物科技有室温孵育洗膜后显影用系统成
);RPMI-1640(2h,,ChemiDocXRS+
限公司槐定碱纯度江苏永健医药科技有像软件分析蛋白条带灰度值计算蛋白
);(≥98%,,QuantityOne,
限公司试剂盒大连美仑生物公司吉萨姆染相对表达水平
);MTT();。
色液上海钰博生物科技有限公司小室实时荧光定量检测
();Transwell、 PCR(RT-qPCR)miR-5195-
基质胶美国康宁蛋白裂解液上海北诺生物表达水平提取细胞总按荧光定量试
();RIPA(3p RNA,PCR
科技有限公司山羊抗兔美国剂盒配置反应体系以为内参进行扩增相对
);IgG-HRP(,U6PCR,
抗体抗体武汉表达量采用-△△Ct法计算上游引物序
GeneCopoeia);E-cadherin、N-cadherin(2。miR-5195-3p
菲恩生物科技有限公司试剂荧光定量列下游引物序
);Trizol、PCR:5’-GCCTGTAGGCATCATCGCCAG-3’,
试剂盒日本列上游引物
(Takara)。:5’-GATAGAGTGACGTGAAGTAG-3’;U6
细胞处理与分组宫颈癌细胞株常规培序列下游引物序列
HeLa:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,:
养于培养基中取对数生长期细胞分别
RPMI-1640,,5’-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3’。
用浓度为的槐定碱处理作统计学分析应用统计软件计量资
、、5g/L, ,
为槐定碱低中高浓度组常规培养的细胞作为对照料符合正态分布以x±s表示组间比较采用t检验
、、,■,2,
组将模拟物及阴性对照转染至细多组间比较采用单因素方差分析组间两两比较采用
;miR-5195-3pHeLa,
胞记为组组将t检验P为差异有统计学意义
,miR-5195-3p、miR-NC;miR-5195-3pLSD-,<。
抑制剂及阴性对照转染至细胞后用的槐结果
HeLa5g/L2
定碱处理记为槐定碱组槐定碱槐定碱对宫颈癌细胞增殖的影响与对
,+anti-miR-5195-3p、 HeLa
组照组比较槐定碱低中高浓度组细胞增殖抑
+anti-miR-NC。,、、HeLa
法检测细胞增殖抑制率各组细胞培养制率升高细胞克隆形成数减少呈浓度依赖性P
MTT ,,(<
按照孔加入溶液孵育后去上清见表
48h20μl/MTT,4h,)。1。
表槐定碱对宫颈癌细胞增殖的影响
按照孔加入二***亚砜振荡反应酶1 HeLa
150μl/,10min,nx±s
标仪测量处吸光度值细胞增殖抑制率=9,■
490nm(OD)。组别抑制率细胞克隆形成数个
(%)()
试验组值对照组值对照组
(%)=(1-OD/OD)×100%。 ±±
槐定碱低浓度组
±∗±∗
槐定碱中浓度组
±∗#±∗#
制成4个细胞悬液取个细胞接种孔槐定碱高浓度组
1×10/ml,±∗#△±∗#△
F值
,,P值
注与对照组比较P与槐定碱低浓度组比较P与槐定碱
,(PBS)2,、 :,∗<;,#<;
萨染色后显微镜下计数个细胞的克隆数中浓度组比较P
,>50。,△<
划痕实验检测细胞划痕愈合率各组细胞消化槐定碱对宫颈癌细胞迁移侵袭的影响
HeLa
后接种于培养板过夜细胞铺满后用枪头直线划痕用与对照组比较槐定碱低中高浓度组细胞划
,,,、、HeLa
冲洗划下的细胞换液后继续培养在培养和痕愈合率侵袭细胞数蛋白表达降低
PBS,,0h、、N-cadherin,E-
拍照观察用软件计算划痕愈蛋白表达升高呈浓度依赖性P见
24h,Image-,(<)。
合率表图
。2,1。
小室法检测细胞侵袭将稀释好的基槐定碱对宫颈癌细胞表达的
Transwell HeLamiR-5195-3p
质胶包被小室上室膜凝固后接种细影响与对照组比较槐定碱低中高浓度组
Transwell,100μl ,、、miR-
胞悬液下室加含血清培养液培养表达水平升高呈浓度依赖性P见
,500μl,37℃24h,5195-3p,(<)。
棉签擦拭掉上层未穿过基底膜的细胞用结晶表
,%
紫染色细胞漂洗遍风干后光学显微镜3。
30min,PBS2,
河北医药年月第卷第期
202274413 HebeiMedicalJournal,2022,
表槐定碱对宫颈癌细胞迁移侵袭的影响nx±s
2 HeLa=9,■
组别划痕愈合率侵袭细胞数个蛋白蛋白
(%)()E-cadherinN-cadherin
对照组
±±±±
槐定碱低浓度组
±∗±∗±∗±∗
槐定碱中浓度组
±∗#±∗#±∗#±∗#
槐定碱高浓度组
±∗#△±∗#△±∗#△±∗#△
F值
P值
注与对照组比较P与槐定碱低浓度组比较P与槐定碱中浓度组比较P
:,∗<;,#<;,△<
过表达对宫颈癌细胞增殖
miR-5195-3pHeLa、
迁移和侵袭的影响与组比较
miR-NC,miR-5195-3p
组表达水平增殖抑制率蛋
miR-5195-3p、、E-cadherin
白表达升高划痕愈合率克隆形成数侵袭细胞数
,、、、
蛋白表达降低P见图表
N-cadherin(<)。2,4。
图槐定碱对宫颈癌细胞迁移侵袭相关蛋白表达的影响
1 HeLa
表槐定碱对宫颈癌细胞表达的影响
3 HeLamiR-5195-3p
nx±s
=9,■
组别
miR-5195-3p
对照组
±
槐定碱低浓度组
±∗
槐定碱中浓度组
±∗#
槐定碱高浓度组
±∗#△
F值
P值
注与对照组比较P与槐定碱低浓度组比较P与槐定碱图过表达对宫颈癌细胞迁移侵袭相关蛋白表达
:,∗<;,#<;2 miR-5195-3pHeLa
中浓度组比较P的影响
,△<
表过表达对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响nx±s
4 miR-5195-3pHeLa=9,■
组别抑制率细胞克隆形成数个划痕愈合率侵袭细胞数个蛋白蛋白
miR-5195-3p(%)()(%)()E-cadherinN-cadherin
组
miR-NC ±±±±±±±
组
miR-5195-±±±±±±±
t值
P值
干扰表达逆转了槐定碱对组表达水平增殖抑制率蛋
miR-5195-3p(5g/L)miR-5195-3p、、E-cadherin
宫颈癌细胞增殖迁移和侵袭的作用与槐定白表达降低划痕愈合率克隆形成数侵袭细胞数
HeLa、 ,、、、
碱组比较槐定碱蛋白表达升高P见表图
+anti-miR-NC,+anti-miR-5195-3pN-cadherin(<)。5,3。
表干扰表达逆转了槐定碱对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用nx±s
5 miR-5195-3pHeLa=9,■
组别抑制率细胞克隆形成数个划痕愈合率侵袭细胞数个蛋白蛋白
miR-5195-3p(%)()(%)()E-cadherinN-cadherin
槐定碱组
+anti-miR-NC ±±±±±±±
槐定碱组
+anti-miR-5195-±±±±±±±
t值
P值
讨论
3
中药具有良好的抗肿瘤活性中药生物碱类成分
,
是近年来研究的热点在治疗恶性肿瘤方面有着较大
,
的优势[9]槐定碱是生物碱的一种研究报道槐定碱
。,
通过激活和信号通路抑制肺癌细胞生长并
P53Hippo
增强顺铂敏感性[10]槐定碱能显著抑制人胶质瘤
。
细胞胰腺癌细胞增殖诱导细胞凋
U87MG、capan-1,
亡[11,12]槐定碱可能通过下调抑制人胃癌
。HMGB3
图干扰表达逆转了槐定碱对宫颈癌细胞迁移侵细胞的增殖促进其凋亡[13]为研究槐定碱
3 miR-5195-3pHeLaMKN45,。
袭相关蛋白表达的作用对宫颈癌细胞的影响本实验用不同浓度槐定
HeLa,
河北医药年月第卷第期
2006202274413 HebeiMedicalJournal,2022,
夏晓华槐定碱对肝癌细胞体外增殖与凋亡的影响江
碱处理细胞结果显示细胞增殖抑制率4 .SMMC-7721.
HeLa,,HeLa、苏大学
,2018.
蛋白表达升高细胞克隆形成数划痕愈合李明潺王玉丽董林易槐定碱对肺癌细胞体外增殖和侵袭
E-cadherin,、5 ,,.A549
率侵袭细胞数蛋白表达降低呈浓度依抑制作用及机制的研究中国药学杂志
、、N-cadherin,.,2015,50:1111-1116.
赖性表明槐定碱可浓度依赖性的抑制细胞增6 WangR,LiuH,ShaoY,
;HeLa
,2019,17:
2469-2479.
、。唐敏万群孙恃雷等对人宫颈癌细胞增
有研究报道通过直接靶向骨肉瘤中7 ,,,.Hsa-miR-5195-3pSiHa
miR-5195-3p殖迁移与侵袭的影响中国生物工程杂志
的抑制细胞增殖并诱导凋亡[14],.,2020,40:22-29.
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的上调抑制了非小细胞肺癌细胞的增殖迁移和侵
3p,,2020,24:
袭[15]通过直接靶向癌基因抑制267-273.
邵莹莹尹双双王恺龙等中药生物碱类成分的抗肿瘤药理作用
。miR-5195-3pKLF59 ,,,.
人膀胱癌细胞的增殖和侵袭[16]本实验结果显示过研究进展中南药学
。,.,2019,17:1460-1465.
表达后细胞增殖抑制率10 ZhuL,HuangS,LiJ,
miR-5195-3p,HeLa、E-
蛋白表达升高划痕愈合率蛋白andenhancescisplatinsensitivitythroughactivationofthep53and
cadherin,、N-,2020,742:144556.
王文鑫陈少伟廖圣芳等槐定碱抑制人胶质瘤细胞株
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槐定碱还可提高表达水平而干扰任丽平李先佳金少举槐定碱对人胰腺癌细胞株增殖及
12 ,,.capan-1
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陈旭东华新宇孔秀敏等槐定碱抑制人胃癌细胞的增
5195-3pHeLa、13 ,,,.MKN45
侵袭的作用殖并促进其凋亡生理学报
。.,2018,70:391-396.
综上所述槐定碱可能通过上调表14 WangL,ShiG,ZhuD,-5195-3psuppressescellproliferation
,miR-5195-3p
达来抑制宫颈癌细胞增殖迁移和侵袭andinducesapoptosisbydirectlytargetingNEDD9inosteosarcoma.
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