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沉默BLM+DNA解旋酶基因对三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖和凋亡的影响.pdf

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沉默BLM+DNA解旋酶基因对三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖和凋亡的影响.pdf

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47 .
年月47 8
JOURNALOFGUIZHOUMEDICALUNIVERSITY .
2022820228
·研究生专栏·
沉默BLM解旋酶基因对三阴性乳腺癌
DNA∗MDA-
细胞增殖和凋亡的影响∗
MB-468
,
黄亚兰1,张望明1,刘小花1,余晓静1,安丽君1,吴介恒1,杨留启1,刘杰麟12∗∗
贵州医科大学基础医学院免疫学教研室贵州贵阳贵州医科大学省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室贵州
(1., 550025;2.,
贵阳
550014)
[摘要]目的探讨沉默BLM解旋酶基因对三阴性乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响
DNAMDA-MB-468。
方法利用数据库分析解旋酶在乳腺癌组织中的表达情况及后评估价值免疫组织化学技术检测三
BLMDNA,
阴性乳腺癌乳腺纤维腺瘤和癌旁组织中解旋酶表达检测细胞细胞
、BLMDNA,WesternblotMCF-10A、MCF-7、
细胞中解旋酶蛋白表达水平合成序列沉默细胞中BLM解旋
MDA-MB-468BLMDNA;siRNAMDA-MB-468DNA
酶基因的表达选取沉默效率最高的序列构建干扰载体慢病毒将慢病毒感染
,siRNA-BLM3shRNA;MDA-MB-
细胞分为组和组平板克隆形成实验检测细胞增殖能力流式细胞术检测细
468shRNA-NCshRNA-BLM,MTT、,
胞凋亡情况单细胞凝胶电泳技术检测与损伤相关的细胞尾部含量免疫细胞化学检测损伤标
,DNADNA,DNA
志物表达情况检测凋亡相关蛋白及损伤修复蛋白表达情况结果生物信息学分
γ-H2AX,WesternblotDNA。
析显示解旋酶在乳腺癌组织中高表达且与乳腺癌患者不良预后密切相关三阴性乳腺癌组织
BLMDNA,;BLM
解旋酶表达水平高于乳腺纤维腺瘤和癌旁组织P与细胞细胞比较
DNA(<);MCF-10A、MCF-7,MDA-MB-
细胞中解旋酶蛋白表达水平升高P与未转染组比较组解旋酶
468BLMDNA(<);,siRNA-BLM3BLMDNA
蛋白表达下调P与组比较组细胞增殖能力被抑制凋亡率升高尾部含
(<);shRNA-NC,shRNA-BLM、、DNA
量增加阳性细胞比例升高P凋亡相关蛋白表达上
、γ-H2AX(<)、Bax、cleavedCaspase-3、cleavedCaspase-8
调及损伤修复蛋白表达下调P结论沉默BLM解旋酶基因
,Bcl-2DNABRCA1、Rad51、BLM(<)。 DNA
表达抑制三阴性乳腺癌细胞增殖促进细胞凋亡凋亡机制可能与细胞损伤增加损伤修复相关蛋白
,,DNA,DNA
受抑制有关

[关键词]乳腺肿瘤细胞增殖细胞凋亡BLM解旋酶基因干扰
;;;DNA;RNA
[中图分类号][文献标识码][文章编号]
A 2096-8388(2022)08-0869-10
DOI
:.2096-
EffectsofsilencingBLMDNAhelicaseexpressiononproliferationand
apoptosisofMDA-MB-triple-negativebreastcancercells
468
11111
HUANGYalan,ZHANGWangming,LIUXiaohua,YUXiaojing,ANLijun,
111,2
WUJieheng,YANGLiuqi,LIUJielin

(,,,,

,;,
GuizhouMedicalUniversityGuiyang550014GuizhouChina
,,,)
AbstractObjectiveBLM
[] ToinvestigatetheeffectsofsilencingDNAhelicaseexpressionon
Methods
proliferationandapoptosisofMDA-MB-468triple-negativebreastcancercells. The
databasewasutilizedtoanalyzeBLMDNAhelicaseexpressionlevelinbreastcancertissuesandits
(IHC)wasappliedtodetectBLMDNAhelicaseexpressionin
triple-negativebreastcancertissues,
基金项目国家自然科学基金贵州省科技支撑项目黔科合支撑贵州医科大学省部共建药用植物功效与利用国家重点实验
∗∗[](81360349);(〔2020〕4Y120);
室开放课题
(FAMP202110K)
通信作者
∗∗E-mail:******@
869
贵州医科大学学报卷
47
usedtodetecttheproteinexpressionofBLMDNAhelicaseinMCF-10A,MCF-7,andMDA-MB-468
BLM

theirsilencingefficacyinMDA-MB--BLM3sequencewiththehighestsilencing
-MB-468cells
wereinfectedwithlentiviruscarryingshRNA-NCorshRNA-BLM,andfurtherdividedintoshRNA-NC
andshRNA-.
-cellgelelectrophoresis(SCGE)was

wasappliedtodetectDNAdamage-associatedγ-
detecttheexpressionlevelsofapoptosis-relatedproteinsandDNAdamagerepair-relatedproteins.
Results
BioinformaticsanalysisshowedthatBLMDNAhelicasewashighlyexpressedinbreastcancer

BLMDNAhelicaseintriple-negativebreastcancertissueswasthehighestrelativetothoseinbreast
P
fibroadenomasandparacanceroustissues(<).Similarly,theexpressionlevelofBLMDNA
helicaseinMDA-MB-468cellswasthehighestrelativetothoseinMCF-10AandMCF-7celllines
P
(<).Whencomparedtothenon-transfectedgroup,theexpressionlevelofBLMDNAhelicase
P
insiRNA-BLM3groupwasdown-regulated(<).Cellproliferationwasdecreased,butcellular
apoptoticrate,DNAcontentsincomettailsandtheproportionofγ-H2AX-positivecellswereincreased
P
inshRNA-BLMgroupwhencomparedtoshRNA-NCgroup(<).Theexpressionlevelsof
apoptosis-relatedproteinssuchasBax,cleavedCaspase-3andcleavedCaspase-8wereupregulated,while
theexpressionlevelsofBcl-2,DNAdamagerepair-relatedproteinssuchasBRCA1,Rad51,andBLMwere
PConclusion
downregulatedinshRNA-BLMgrouprelativetoshRNA-NCgroup(<). Silencing
BLM
DNAhelicaseexpressioninhibitsthetriple-negativebreastcancercellproliferationandpromotes

ofDNAdamagerepair-relatedproteins.
KeywordsBLM
[]breastcancer;cellularproliferation;cellularapoptosis;DNAhelicasegene;RNA
interference
乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤之一研究表明解旋酶与癌症的发展有着密
,BLMDNA
也是女性癌症患者死亡的主要原因[1-2]根据乳切联系[8-9]解旋酶表达增加与
。,BLMDNAmRNA
腺癌激素表达情况以及基因表达可将乳腺癌分为乳腺癌患者无远处转移生存期的减少相关[10]课

型型过表达型及三题组前期研究发现解旋酶蛋白在结肠
LuminalA、LuminalB、HER-2BLMDNA
阴性型多种亚型[3]其中三阴性乳腺癌癌及癌旁组织中均有表达但在癌组织中表达更
,(tripleneg-,
易发生侵袭转移导致局高且与临床分期相关[11]前列腺癌组织和
ativebreastcancer,TNBC)、、TNM。
部和远处复发率高是乳腺癌亚型中预后较差的一细胞中解旋酶的表达明显高于非前列
,BLMDNA
种的定义是不表达雌激素受体孕腺癌组织和细胞干扰解旋酶的表达可
。TNBC(ER)、,BLMDNA
激素受体和人类表皮生长因子受体抑制前列腺癌细胞增殖并促进细胞凋亡从而减
(PR)-2(HER-,,
因此对内分泌药物缺乏敏感性以及靶向治疗缓疾病的进程[12]目前关于解旋酶在
2),,。BLMDNA
的选择有限使这类肿瘤的替代治疗策略备受关中的作用研究较少本研究在体外以三阴性
,TNBC,
注[4]解旋酶是一个在细菌真菌植物乳腺癌细胞为研究对象探讨沉默
。RecQDNA、、MDA-MB-468,
和动物中发现的蛋白质家族是一类通过水解BLM解旋酶基因对乳腺癌细胞增殖和凋亡的
,ATPDNA
高能磷酸键获得能量后解开双链结构并产生影响及机制为分子靶向治疗提供依据
、DNA,TNBC。
单链的酶[5]人体内含有种解
DNA。5RecQDNA1材料与方法
旋酶分别是和
,RECQL1、BLM、WRN、RECQL4RE-

CQL5,,
复制转录修复和端粒维持等[6-7]
DNA、、DNA。 2012—2014
870
期黄亚兰等沉默BLM解旋酶基因对三阴性乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响
8 DNAMDA-MB-468
腺癌例乳腺纤维腺瘤例和癌旁正常对照石胞用专用培养基培养乳腺癌细胞及三阴
30、20,MCF-7
蜡包埋组织例临床资料完整所有患者在手术性乳腺癌细胞在含胎牛血清
12,,MDA-MB-468,10%
切除肿瘤前均未进行放化疗全部的人组织标本的培养液中培养均置培养
。DMEM,37℃、5%CO2
使用按照贵州医科大学附属医院生物伦理学会的箱中培养


,。 siRNA

MCF-3DNAsiRNA
细胞购自中国科学院细胞库乳腺癌列和对阴性对照正义链
10A,MCF-71siRNA。siRNA-BLM1
细胞及三阴性乳腺癌细胞由贵州医为反义链为
MDA-MB-4685′-CGGCCAAUUAAAUCAGUAUTT-3′,
科大学免疫学实验室保存培养基青霉素
,DMEM、5′-AUACUGAUUUAAUUGGCCGTT-3′;siRNA-BLM
和链霉素美国公司胎牛血清杭州四季正义链为
(Gibco),(25′-GGAGGUGGUAAGAGUUUGUTT-3′,
青公司美国公反义链为
),Lipofectamine2000(Invitrogen5′-ACAAACUCUUACCACCUCCTT-3′;
司强裂解液蛋白浓度测定试剂盒江正义链为
),RIPA、BCA(siRNA-BLM35′-GCCACAUGUAGAAAG
苏碧云天公司试剂北京索莱宝公司细胞反义链为
),MTT(),AUAUTT-3′,5′-AUAUCUUUCUACAU-
凋亡试剂盒杭州联科生物公司抗体美国正义链为
(),BLM(GUGGCTT-3′;NegativeControl5′-UU-
公司反义链为
SantaCruzBiotechnology),γ-H2AX、Bax、Bcl-2、CUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,5′-
抗体成都正能染前将
cleavedCaspase-3、cleavedCaspase-8(ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。24h
生物公司抗体北京博奥森生物公司细胞以每孔5个铺至孔板
),Rad51(),MDA-MB-4685×106,
抗体武汉三鹰生物公司抗体转染时设置个组分别为转染组
BRCA1(),GAPDH5(Control)、siRNA-
武汉赛维尔公司和
()。NC、siRNA-BLM1、siRNA-BLM2siRNA-BLM3,

(Lipofectamine2000,
司恒温干燥箱上海医疗器械厂超微量微孔转染试剂说明书转染后用含胎牛血清
),(),。6h,10%
板分光光度计美国公司正置荧光显微的培养液更换孔板中的转染液体于
(biotek),DMEM6,
镜倒置荧光显微镜日本尼康公司流式细胞分培养箱中继续培养后提取细胞
、(),37℃、5%CO248h
析仪美国公司蛋白检测沉默效果软件测量各组条带灰度值
(BD)。,(A)。

(%)=[1-(ABLM×AGAPDH)/
()染色检测干扰组未转染组选取沉默效率
IHCBLMDNA(AGAPDH×ABLM)]×100%,
解旋酶的表达利用二步法检测三阴性乳腺最高的序列构建干扰载体慢病毒
IHCsiRNAshRNA,
癌乳腺纤维腺瘤和癌旁组织中解旋酶由上海吉凯基因公司完成
、BLMDNA。

,BLMDNA
度为由有经验的病理学专业老师对切片长期的细胞以5个孔接种到
1∶500。MDA-MB-4685×10/
染色进行评估细胞核或和细胞浆出现棕孔板中将实验分为组和
IHC,()6。shRNA-NCshRNA-
黄色即认为是解旋酶蛋白质的阳性表组分别为感染阴性对照慢病毒组和感染
BLMDNABLM,
达免疫组织化学评分根据染色的强度和重组慢病毒组感染步骤去除孔
。(IHS)shRNA-BLM。:6
阳性表达细胞的百分比染色强度的评分标准阴板内液体加慢病毒感染增强液
。:,DMEM1mL、Hi-
性未着色为分弱阳性淡黄色为分中度及病毒液培养更换细
()0,()1,transGP40μL15μL,12h
阳性棕黄色为分强阳性棕色为分阳胞培养液继续培养用含嘌呤霉素的
()2,()3。,3d,2mg/L
性细胞百分比的评分标准阳性细胞比例培养基筛选稳定沉默BLM解旋酶基因的细
:≤5%DNA
阴性为分阳性细胞比例弱阳性胞株用于后续实验序列为
()0,6%~25%()。shRNA-NCTTCTC-
为分阳性细胞比例中度阳性为序列为
1,26%~50%()2CGAACGTGTCACGT,shRNA-BLMGCCA-
分阳性细胞比例阳性为分阳性
,51%~75%()3,CATGTAGAAAGATAT。
法检测细胞活力将组
≥76%()4。MTT shRNA-BLM
白质染色指数为染色强度评分与阳性细胞比和组细胞接种至孔板接种密度为
IHCshRNA-NC96,
例评分的乘积4个孔于培养箱及饱和
。×10/,37℃、5%CO2

MCF-10A24h、48h、72h,MTT
871
贵州医科大学学报卷
47
继续培养弃去上清液每孔加基硫酸钠聚丙烯酰***凝胶电泳采用湿转法将
20μL4h,,DMSO-。
震荡后用微量微孔板分光光度计在蛋白转移至膜脱脂牛奶封闭
150μL,490nmPVDF,5%2h,TBST
处检测各孔光吸收值洗涤三次分别加入一抗
(OD)。,BLM、Bax、Bcl-2、cleaved
平板克隆形成实验检测细胞集落形成能力
Caspase-3、cleavedCaspase-8、Rad51、BRCA1、GAP-
组和组细胞以每孔稀释均为孵育过夜
shRNA-BLMshRNA-NC3×DH(TBST,1∶1000),4℃,
3个孔接种在含有培养液的孔板中洗膜加入对应标记的二抗稀
10/,TBST,HRP(TBST
置于培养箱中培养后弃去培释室温孵洗膜后曝光显影
37℃,5%CO2。8d,,1∶4000),2h,TBST。
养液洗涤两次多聚甲醛室温固定以作为内参软件用于分析蛋白条
,PBS,4%GAPDH,ImageJ
结晶紫染色蒸馏水将染液冲带灰度值计算目的蛋白相对表达量
20min,%20min,,。

,。

shRNA-,
组和组细胞用预冷洗涤两组间比较采用单因素方差分析计量资料用均数
BLMshRNA-NC,PBS,±
次离心后弃掉上清液加入工标准差xs表示以P表示差异有统计
,。1×BindingBuffer(±),<
作液重悬细胞在每管细胞样本中各加入学意义
,7-AAD。
和用移液器轻轻混
10μLAnnexinV-APC5μL,
匀室温条件下避光染色上机检测2结果
,5min。

DNA BLMDNA
在组和组细胞中加入在数据库中发现解旋酶在
shRNA-BLMshRNA-NCTCGABLMDNA
调整细胞密度为6个配制胆管癌食管癌胶质母细胞瘤等常见恶性肿瘤以
PBS,1×10/mL。%、、
普通正常熔点的琼脂糖覆盖至载玻片上干燥后及其对应的正常组织之间存在差异表达与正常
,,。
为第一层胶取细胞悬液与低熔点组织比较解旋酶在大多数肿瘤中呈现
。%,BLMDNA
琼脂糖混匀滴加至第一层胶上将载玻片高表达图在乳腺癌呈明显高表达图
75μL,。(1A),(1B)。
浸入细胞裂解液中裂解洗涤载玻在数据库中发现解旋酶高
,4℃2h,PBS。GEOBLMDNAmRNA
片放置在水平电泳槽中加入碱性电泳缓冲液室表达与乳腺癌患者总生存期无复发生存期
,,(OS)、
温条件避光解旋设置电压为电泳降低相关图结果显示
1h。25V、(RFS)(1C,D)。IHC,BLM
取出载玻片缓冲液解旋酶的阳性着色定位于细胞核和细胞质
30min,,-HCL
中和次每次滴加染液至凝DNA
3、10min。PI20μL图解旋酶在组织中表达高
胶上于正置荧光显微镜下观察分析细胞尾部(1E),BLMDNATNBC
,,于乳腺纤维腺瘤和癌旁组织差异有统计学意义
含量,
DNA。P表在乳腺纤维腺瘤和癌旁组织之
(<,1);
γ-H2AX PBS间比较差异无统计学意义P表
胞样本多聚甲醛室温固定洗涤,(>,1)。
,4%20min,PBS3结果显示细胞中
次每次滴加通透液Westernblot,TNBCMDA-MB-468
、3min;1%TritonX-1004min,解旋酶蛋白表达水平显著高于正常乳腺
漂洗次配制室温封闭BLMDNA
PBS3;PBS3%BSA,上皮细胞和乳腺癌细胞差异有
洗涤以稀释抗MCF-10AMCF-7,
30min,PBS;PBS400∶1γ-H2AX统计学意义图P
体加至样本上过夜室温平衡后加(1F,<)。
,,4℃。30min,表1 三阴性乳腺癌、乳腺纤维腺瘤和癌旁组织中
入山羊抗鼠二抗孵育漂洗次
,37℃1h,PBS3;BLMDNA解旋酶的表达
显色漂洗滴加苏木素染液室温
DAB1min,PBS,, BLMDNAhelicaseexpressionintriple-
下染色蒸馏水冲洗通风条件下晾干后滴
3min,。negativebreastcancer,breastfibroadenoma,
加中性树胶封片显微镜下观察计数阳性
,γ-H2AXandparacanceroustissues
细胞
。指标n分
法检测细胞损伤修复 IHS/
(1)
±
相关蛋白及凋亡相关蛋白表达提取各组细胞蛋乳腺纤维腺瘤(2)
±
白法检测蛋白浓度加入蛋白上样缓冲液煮癌旁组织
,BCA,±
()()
沸使蛋白充分变性加入蛋白样品后进行十二烷注:1与其他组比较,P;2与癌旁组织组比较,P。
,。<>
872
期黄亚兰等沉默BLM解旋酶基因对三阴性乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响
8 DNAMDA-MB-468
注:、为在数据库中分析解旋酶在组织中的表达情况,、为在数据库中分析解旋酶在乳腺癌
ABTCGABLMDNACDGEOBLMDNA
患者中的预后价值,为检测解旋酶在组织中的表达情况(显色),为检测
EIHCBLMDNADABFWesternblotBLMDNA
()
解旋酶在细胞中的表达情况及定量结果;1与和组比较,P。
MCF-10AMCF-7<
图1 组织及细胞中BLMDNA解旋酶表达情况
ExpressionofBLMDNAhelicaseintissuesandcells

MDA-MB-468,siRNAMDA-MB-468
BLM解旋酶基因的表达细胞图蛋白印迹结果显示与组比
DNA(2A)。,Control
为了沉默三阴性乳腺癌细胞中BLM解较实验组解旋酶表达水
DNA,siRNA-BLM3BLMDNA
873
贵州医科大学学报卷
47
平下降蛋白沉默效率为图P法检测解旋酶蛋白沉默效果如图
,%(2B,<BLMDNA,3B
选取沉默效率最高的序列构建所示与组相比较组
)。siRNA-3,shRNA-NC,shRNA-BLMBLM
干扰载体慢病毒将干扰载体慢病解旋酶蛋白表达显著下调差异有统计学意
shRNA,shRNADNA,
毒感染细胞图义P
MDA-MB-468(3A)。Westernblot(<)。
注:为细胞转染荧光基团标记的序列后于光学显微镜、荧光显微镜下视野();为解旋酶蛋白
AFAMsiRNA100×BBLMDNA
()()
表达情况及定量结果;1与组比较,P;2与组比较,P。
Control<-NC<
图2 转染siRNA序列后MDA-MB-468细胞中BLMDNA解旋酶蛋白的表达
ExpressionofBLMDNAhelicaseproteininMDA-MB-468cellsaftertransfectionwithsiRNAsequences
注:为细胞感染标记的质粒慢病毒后于光学显微镜、荧光显微镜下视野();
AGFPshRNA100×
()
为解旋酶蛋白表达情况及定量结果;1与组比较,P。
BBLMDNAshRNA-NC<
图3 感染干扰载体慢病毒对MDA-MB-468细胞中BLMDNA解旋酶蛋白表达的影响
EffectoftheinfectionwithlentiviruscarryingshRNAagainstBLMDNAhelicasegeneon
BLMDNAhelicaseexpressioninMDA-MB-468cells
874
期黄亚兰等沉默BLM解旋酶基因对三阴性乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响
8 DNAMDA-MB-468

DNAMDA-MB-,shRNA-BLM(194±31),shR-
细胞增殖、集落形成能力组细胞集落数为组
468NA-NC(10±2),shRNA-BLM
检测结果显示与组比较细胞集落数低于组图P
MTT,shRNA-NC,shRNA-NC(4B,<
组细胞生长曲线上升平缓提示下调解旋酶表达显著抑
shRNA-BLM。shRNA-)。BLMDNA
组的值均低于组制细胞生长及集落形成能力使其
BLM48h、72hODshRNA-NCMDA-MB-468,
图P平板克隆形成实验结果显增殖减慢
(4A,<)。。
()
注:为实验结果,为平板克隆形成实验结果及定量结果;1与组比较,P。
AMTTBshRNA-NC<
图4 BLMDNA解旋酶基因沉默对细胞增殖及集落形成能力的影响
EffectsofsilencingBLMDNAhelicaseoncellularproliferationandcolonyformation

DNAMDA-MB-NA-NCshRNA-BLM
细胞