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2022年4月HEBEIMEDICINEApr.,2022
[]杨春,汪小海二氧化碳气腹相关的肝肾损伤的研究进展
.
[]医学综述,,():[]刘雨辰,朱熠林,陈杰,等不同腹腔镜腹股沟疝修补术中
~.
[],二氧化碳气腹对酸碱平衡影响随机对照研究[]中国实
2NabihESEl-.
:用外科杂志,,():
andmiR-21byrosuvastatinroleinalleviatingcholestatic2021414415~418.
[][]刘云霞,于洪丽,朱敏,等通路在丙
--CnA-Drp1
,,():泊酚减轻小鼠肝缺血再灌注致肾损伤中的作用[]中
Pharmacol2019392137~.
[],,,华麻醉学杂志,,():
-2021416680~684.
[]马伟科,杨卫国,林燕鸿,等血清表达、
chemiareperfusioninjuryviainhibitingbnip3-mediatedoxi--122a
[],,():水平对脓毒症并发肝损伤患儿预后的预测效能
~
[]奉光举,冯洁华,罗晓敏,等二氧化碳气腹下丙泊酚脂肪[]山东医药,,():
~24.
乳含量对血浆浓度与、的影响[]现[]袁苏榆,丁洋生物标志物在对乙酰氨基酚致肝损伤治
CGRPIL-6TNF-.
代医院,,():疗中的应用[]肝脏,,():
2019196904~~125.
[]邹海波,杨竹,王颖,等二氧化碳气腹对大鼠肝脏造成的[],,,
缺血再灌注损伤及异丙酚促进表达的保护作用
HO-1ischemia/reperfusioninjuryinmiceviainhibitingHMGB1-
[]实用药物与临床,,():[],,():
~
[]文洋,鞠科丙泊酚通过通路对脑缺血
-12247~2255.
大鼠发挥神经保护作用[]中国药师,,():[],,,
-
~-γexpressioninCD38-/-
[]向红霞,张硕,刘佳,等刺梨金银花速溶茶珍对化学性肝[],,():
~789.
损伤的保护作用[]食品工业科技,,():[],,,(
~-
,)
[],,,,,,
-IL-6solubleICAM-1RANTESandMCP-2fromAβ-
[],,():
:,
surgeryinpaediatricpatientsaprospectiveobservational1386~1395.
[],,():
~
【文章编号】1006-6233(2022)04-0544-07
硼替佐米对人甲状腺癌细胞凋亡侵袭及AMPK/mTOR/4EBP1
通路的影响
贺椿媛,梁金环,王翠,徐倩
(沧州医学高等专科学校基础医学部生物化学教研室,河北沧州061000)
【摘要】目的:探究硼替佐米对人甲状腺癌()细胞凋亡、侵袭的影响及可能的作用机制。方
TC
法:体外培养人甲状腺乳头状癌细胞,法筛选硼替佐米的实验浓度及时间;取指数增长期
B-CPAPMTT
的甲状腺癌细胞,分为对照组、组(激活剂)、硼替佐米()组、
B-CPAPAICARAMPK2mmoL/L50nmoL/L
硼替佐米组(硼替佐米抑制剂);流式细胞仪检
+CompoundC50nmoL/L+AMPKCompoundC5μmoL/L
测各组细胞凋亡率;实验检测细胞侵袭能力;检测细胞凋亡、侵袭以及
B-CPAPTranswellWesternBlot
通路相关蛋白的表达[细胞淋巴瘤白血病基因()、半胱氨酸天冬氨酸
AMPK/mTOR/4EBP1B/-2Bcl-2
蛋白酶()、钙黏连蛋白()、连接素()、腺苷酸活化蛋白激酶
-3Caspases-3E-E-cadherinβ-β-catenin
()、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白()、真核翻译起始因子结合蛋白()及其磷酸化
AMPKmTOR4E14E-BP1
蛋白]。结果:不同浓度的硼替佐米能不同程度的抑制细胞的生长,与对照组相比,组
B-CPAPAICAR
和硼替佐米组细胞凋亡率、、、的表达、的比值
B-CPAPCaspases-3E-cadherinβ-cateninp-AMPK/AMPK
显著升高(),进入小室下层的数量、的表达、、
P<-2p-mTOR/mTORp-4EBP1/4EBP1
的比值显著降低(),且组与硼替佐米组之间无明显统计学差异();使用抑
P<>
制剂可升高、的比值,明显减弱硼替佐米对甲状腺癌
CompoundCp-mTOR/mTORp-4EBP1/4EBP1B-
【基金项目】河北省沧州市重点研发计划指导项目,(编号:)
172302090
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细胞侵袭的抑制作用及促凋亡作用。结论:硼替佐米可抑制人甲状腺癌细胞增殖、侵袭,并诱导
CPAP
细胞凋亡,其作用机制可能与激活,抑制和的活化有关。
AMPKmTOR4EBP1
【关键词】硼替佐米;甲状腺癌;凋亡;侵袭
【文献标识码】A【doi】.1006-
EffectsofBortezomibonApoptosisInvasionandAMPK/mTOR/4EBP1
PathwayinHumanThyroidCarcinomaCells
HEChunyuan,LIANGJinhuan,WANGCui,etal
(DepartmentofBasicMedicine,CangzhouMedicalCollege,
HebeiCangzhou061000,China)
【Abstract】Objective:
Toexploretheeffectsofbortezomibonapoptosisandinvasionofhumanthyroid
()Methods:
-CPAP
,
cellswereculturedinvitroandtheexperimentalconcentrationandtimeofbortezomibwerescreenedwith
;,
MTTthyroidcarcinomaB-CPAPcellsattheexponentialgrowthstageweredividedintocontrolgroupAIC-
(),(),
ARgroupAMPKactivator2mmol/Lbortezomib50nmol/Lgroupbortezomib+CompoundCgroup
();
bortezomib50nmol/L+AMPKinhibitorCompoundC5μmol/Lflowcytometrytodetecttheapoptosisrate
;;
ofB-CPAPcellsineachgroupTranswelltesttodetectcellinvasionabilityWesternBlottodetectapopto-
,[
sisinvasionandtheexpressionofAMPK/mTOR/4EBP1pathway-relatedproteinsB-celllymphoma/leuke-
(),(),,,
mia-2geneBcl-2cysteineasparticprotease-3Caspases-3E-cadherinβ-cateninadenosine
(),(),
monophosphateactivatedproteinkinaseAMPKmammaliantargetofrapamycinmTOReukaryotic
()]Results:
translationinitiationfactor4Ebindingprotein14E--
entconcentrationsofbortezomibinhibitedthegrowthofB-
,,,,,
controlgrouptheapoptosisrateofB-CPAPcellstheexpressionofCaspases-3E-cadherinβ-catenin
(),
andtheratioofp-AMPK/AMPKweresignificantlyhigherintheAICARandbortezomibgroupsP<
,,,
andtheentryTranswelllowerlayerexpressionofBcl-2p-mTOR/mTORandp-4EBP1/4EBP1ratiowere
(),
significantlylowerP<
();
bortezomibgroupsP>-mTOR/
,,
mTORp-4EBP1/4EBP1andsignificantlyreducedtheinhibitoryeffectandthepro-apoptoticeffectofbort-
Conclusion:
ezomibontheinvasionofthyroidcarcinomaB-
,
-
tivationofAMPKandinhibitionofmTORand4EBP1activation.
【Keywords】;;;
BortezomibThyroidcarcinomaApoptosisInvasion
甲状腺癌(,)是内分泌系统中性甲状腺髓样癌的临床期试验研究显示,硼替佐
thyroidcarcinomaTCⅠ/Ⅱ[]
最常见的恶性肿瘤,包括分化型甲状腺癌(乳头状癌、米在治疗中具有安全性和耐受性好的特点4;体外研
[][]
滤泡状癌)、甲状腺未分化癌和甲状腺髓样癌1。近究也显示硼替佐米可诱导细胞凋亡5,是尚无确
TC
年来,其发病率逐渐升高,且女性患者居多;临床治疗定治疗方案的患者的一种有前途的治疗方法。然
TC
方法仍以手术治疗为主,放、化疗为辅的综合模式治而,关于硼替佐米在甲状腺癌中的作用的报道很少。
疗,但晚期分化型、未分化型甲状腺癌对临床常用的放腺苷酸活化蛋白激酶(
adenosinemonophosphateactiva-
化疗治疗敏感度较差,且对患者的生存率并无明显提,)哺乳动物雷帕霉素靶蛋白
[]tedproteinkinaseAMPK/
高2,故寻找更佳的治疗手段为临床研究的重点。硼(,)通路的激活与
mammaliantargetofrapamycinmTOR[,]
替佐米()是一种蛋白酶体抑制剂,在治疗甲状腺肿瘤细胞凋亡和细胞周期停滞密切相关67,
Bortezomib
难治性或复发性骨髓瘤、淋巴瘤以及某些实体肿瘤中而硼替佐米可诱导激活,进而诱导骨髓瘤细
[]AMPK[,]
具有令人瞩目的疗效3,最近,一项局部晚期或转移胞、人结肠癌细胞凋亡和自噬89;硼替佐米对细
TC
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胞凋亡的诱导作用是否与通路有关还硼替佐米(、、、、)的培养基继续
AMPK/
未知,因此本研究以细胞为对象,探究硼替佐米对培养、。然后在各孔中加入试剂
TC2448h5g/LMTT
人细胞凋亡、侵袭的影响及潜在的作用机制;以明;继续培养,弃上清后加入的;在
TC20μL4h150μLDMSO
确硼替佐米的具体作用机制,从而为硼替佐米应用于处测定各组细胞的值,将不含细胞的培养
490nmOD
甲状腺癌治疗提供理论基础。基作为空白对照组,计算细胞存活率;并采用
Graph-
1材料与方法软件计算硼替佐米对细胞的半数抑制浓度(
Padthe
11细胞:人甲状腺乳头状癌细胞株(美国,)。细胞存活率(实
.B-CPAPhalfinhibitoryconcentrationIC50=
)购自上海子实生物科技有限公司,货号:验组空白对照组)(对照组空白对照组
ATCCOD-OD/OD-
。在含有胎牛血清和青霉素链霉素)
os10040710%1%-OD×100%
的培养基中,于、的细胞培养132流式细胞术检测细胞凋亡:取指数增长期的甲
RPMI-164037℃5%CO2..
箱中进行培养,隔天换液,每传代一次,在细胞状腺癌细胞,按每孔6个接种于孔
2-3dB-CPAP2×1024
达到指数增长期时开始实验。板,分为对照组、组(激活剂
[]AICARAMPK2mmoL/
12主要试剂与仪器:注射用硼替佐米(万珂,意大利)10、硼替佐米()组、硼替佐米
.L50nmoL/L+Compound
,分包装:西安杨森制药有限组(硼替佐米抑制剂
BSPPharmaceuticalsSRLC[]50nmoL/L+AMPKCompoundC
公司,批准文号:国药准字);)7;给予相应的处理后在的培
J20171067CompoundC5μmoL/L37℃5%CO2
(抑制剂,美国,货号:);养箱中继续培养。培养后,胰蛋白酶消化制
AMPKTargetMoS7840AICAR48h48h
(激活剂,碧云天生物科技公司,货号:);成单细胞悬液,调整细胞浓度为6个,管
AMPKS15151×10/mLEP
胎牛血清、胰蛋白酶、培养基均购自美国中加入单细胞悬液,然后加入
RPMI1640100μLAnnexinV-FITC
公司;二***亚砜(,美国公司);和各,避光孵育后加入
GIBCODMSOSigmaPI5μL15min1×BlindingBuff-
人工重构基底膜胶()(美国公司,货号:,内使用流式细胞仪检测各组细
MatrigelBDer400μL1hB-CPAP
);小室(美国公司,货号:胞凋亡率。
356234TranswellCorning
);四***偶氮唑盐比色法()试剂盒133实验检测细胞侵袭能力:细胞按照
3413MTT..Transwell1.
()、细胞凋亡检测试剂盒项下操作步骤进行分组和培养,取培养后的各
C0009SAnnexinV-
()、裂解液()、试剂盒组细胞,用无血清的细胞培养液调整细胞浓
C1062LRIPAP0013BBCAB-CPAP
()均购自碧云天生物科技公司;度为4个,将胶稀释后加到
P0010AMPK5×10/mLMatrigelTranswell
()、()、()、上室,风干过夜后,分别加入细胞悬液(无血
ab32047p-AMPKab133448mTORab32028p200μL
()、真核翻译起始因子结合蛋白清),下室加入含胎牛血清的
-mTORab1092684E1400μL10%RPMI1640
(培养基,置于、培养箱中培养,取出
eukaryotictranslationinitiationfactor4Ebindingprotein37℃5%CO224h
,)()、()、细胞淋小室,乙醇固定,结晶紫染液染色,
14EBP1ab2606p-4EBP1ab278686BTranswell95%%
巴瘤白血病基因()()、半胱氨酸清洗小室下表面,用湿棉签小心擦除上室底部
/-2Bcl-2ab196495ddH2O
天冬氨酸蛋白酶()()、钙黏膜表面的细胞。晾干后在显微镜下随机取个视野,
-3Caspases-3ab184787E-3
连蛋白()()、连接素(拍照;取细胞穿膜数,计算平均值表示细胞侵袭能力。
E-cadherinab133597β-β-cate-
)()、()、山羊抗兔134检测细胞凋亡、侵袭以及
ninab32572β-actinab8227IgGH&L..WesternBlotAMPK/
()()均购自英国公司。细胞培通路相关蛋白的表达:使用裂解
HRPab205718abcammTOR/4EBP1RIPA
养箱(美国公司);倒置荧光显液提取各组细胞中蛋白质,试剂盒测量上清液中
ThermoFisherScientificBCA
微镜(,日本公司);多功能酶标仪的总蛋白浓度。取等量蛋白质样品()上样,然后
IX73Olympus30μg
()、流式细胞仪()、蛋白转膜装在上进行电泳分离,并将其转移到
iMark680FACSCantoⅡSDS-PAGEPVDF
置购自美国公司。膜上。脱脂牛奶封闭,并在下与一抗(、
Bio-Rad5%4℃AMPKp
13方法、、、、、、
.-AMPKmTORp-mTOR4EBP1p-4EBP1Bcl-2
131法筛选硼替佐米的实验浓度及时间:取指、、、)孵育过
..MTTCaspases-3E-cadherinβ-cateninβ-actin
数增长期的甲状腺癌细胞,以3细胞夜。第天,洗去一抗,加入二抗()孵育,然后
B-CPAP2×10/2IgG2h
孔的浓度接种到孔板中(边缘孔用填充),待使用化学发光试剂盒()进行显色。以为
96PBSECLβ-actin
细胞贴壁并铺满孔底后,弃去原培养基,更换含低浓度内参,分析结果。
()血清的培养基饥饿培养后,加入含不同浓度14统计分析:以上所有实验均重复三次。采用
2%24h.
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统计软件处理相关数据,数据以平均值标表2各组B-CPAP细胞凋亡率的比较(,,)
±x¯±s%n=3
准差()表示。多组间比较采用单因素方差分析,
x¯±s组别细胞凋亡率
组间有差异进一步采用检验。为差异
SNK-qP<
有统计学意义。±
2结果组a
±
硼替佐米的体外细胞实验浓度不同浓度的硼替
21:硼替佐米组a
.±
佐米能不同程度的抑制细胞的生长,见表;
B-CPAP1硼替佐米组abc
不同浓度的硼替佐米在培养时,与对照组相比,细+±
24h
胞存活率差异不甚明显;不同浓度的硼替佐米在培养注:与对照组相比,;与组相比,;
aP<<
时,与对照组相比,细胞存活率显著降低,硼替佐与硼替佐米组相比,
48hcP<
米对细胞的为,因此,选23各组甲状腺癌细胞侵袭能力:与对照组
B--CPAP
择的硼替佐米作用作为后续实验浓度相比,组和硼替佐米组细胞进入
50nmoL/L48hAICARB-CPAPTr-
和时间小室下层的数量显著降低();与
。answellP<
组相比,硼替佐米组细胞进入小室
B-CPAPTranswell
表1硼替佐米对B-CPAP细胞活力的影响(,,)下层的数量无明显统计学差异();与硼替佐米
x¯±s%n=3P>
组相比,硼替佐米组细胞进入
硼替佐米浓度+CompoundCB-CPAP
小室下层的数量明显增加();见图、
()24h48hTranswellP<
nmoL/L表。
3
±±
±±
±±
±±
±±
±±
22各组甲状腺癌细胞凋亡率:与对照组相
.B-CPAP
比,组和硼替佐米组细胞凋亡率显著
AICARB-CPAP图各组细胞的侵袭能力
升高();与组相比,硼替佐米组细胞凋2B-CPAP
P<-CPAP细胞侵袭能力的比较(,个,)
亡率无明显统计学差异();与硼替佐米组相x¯±sn=3
P>
比,硼替佐米组细胞凋亡率明显降低(组别进入下层细胞数
+CompoundCP
见图表
);、。对照组
<±
组a
±
硼替佐米组a
±
硼替佐米组abc
+±
注:与对照组相比,;与组相比,;
aP<<
与硼替佐米组相比,
cP<
24各组甲状腺癌细胞凋亡、侵袭相关蛋白
.B-CPAP
的表达:与对照组相比,组和硼替佐米组
AICARB-
图各组细胞凋亡检测结果细胞、、的表达
1B-CPAPCPAPCaspases-3E-cadherinβ-catenin
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显著增加,的表达显著降低();与硼替佐米组细胞、
Bcl-2P<-+CompoundCB-CPAPCaspases-3
组相比,硼替佐米组细胞上述蛋白表达、的表达明显降低,的表达
ARB-CPAPE-cadherinβ-cateninBcl-2
量无明显统计学差异();与硼替佐米组相比,明显增加();见图、表。
P><
表4各组B-CPAP细胞凋亡侵袭相关蛋白的表达比较(,个,)
x¯±sn=3
组别
Bcl-2Caspases-3E-cadherinβ-catenin
对照组
±±±±
组aaaa
±±±±
硼替佐米组aaaa
±±±±
硼替佐米组abcabcabcabc
+±±±±
注:与对照组相比,;与组相比,;与硼替佐米组相比,
aP<<<
25各组甲状腺癌细胞细胞上述蛋白表达量无明显统计学差异(
.B-CPAPAMPK/mTOR/B-CPAPP>
通路相关蛋白的表达:与对照组相比,);与硼替佐米组相比,硼替佐米组
+CompoundC
组和硼替佐米组细胞的比细胞的比值明显降低,
B-CPAPp-AMPK/AMPKB-CPAPp-AMPK/AMPKp-
值显著增加,、的比、的比值明显增加(
p-mTOR/mTORp-4EBP1/4EBP1mTOR/mTORp-4EBP1/4EBP1P<
值显著降低();与组相比,硼替佐米组);见图、表。
P<
表5各组B-CPAP细胞AMPK/mTOR/4EBP1通路相关蛋白的表达比较(,)
x¯±sn=3
组别
p-AMPK/AMPKp-mTOR/mTORp-4EBP1/4EBP1
对照组
±±±
组aaa
±±±
硼替佐米组aaa
±±±
硼替佐米组abcabcabc
+±±±
注:与对照组相比,;与组相比,;与硼替佐米组相比,
aP<<<
图各组甲状腺癌细胞凋亡、侵袭相关蛋白的图各组甲状腺癌细胞
3B-CPAP4B-CPAPAMPK/mTOR/4EBP1
表达通路相关蛋白的表达
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3讨论、的比值降低,而使用
mTOR/mTORp-4EBP1/4EBP1
硼替佐米是一种人工合成的双肽基硼酸盐二肽化抑制剂可升高、
AMPKCompoundCp-mTOR/mTORp-
合物,具有抗增殖和抗肿瘤活性,可诱导细胞周期停滞的比值,明显减弱硼替佐米对甲状腺癌
4EBP1/4EBP1
和凋亡;已被批准用于难治性复发性多发性骨髓瘤和细胞的促凋亡作用,提示硼替佐米可能通过
/[]B-CPAP
套细胞淋巴瘤的治疗。罗雨等11发现硼替佐米可抑激活,抑制和的活化,诱导甲状腺
AMPKmTOR4EBP1
制甲状腺未分化癌细胞增殖、迁移和侵袭,并促进其凋乳头状癌细胞凋亡。
[]
亡;等5的研究表明硼替佐米和抑制综上所述,硼替佐米可抑制人甲状腺癌细胞增殖、
TsumagariBRAF
剂维拉非尼联合使用,在体外和体内均可诱导甲状腺侵袭,并诱导细胞凋亡,其作用机制可能与激活
癌细胞生长抑制、期细胞周期阻滞和细胞凋亡增,抑制和的活化有关。本研究仅
G2AMPKmTOR4EBP1
加,并使甲状腺癌细胞对抑制剂敏感。从体外细胞水平上初步探究了硼替佐米对人甲状腺乳
BRAFE-cad-
普遍存在于各类上皮细胞中,通常与头状癌细胞的影响,由于体内外肿瘤微环境
herinβ-cateninB-CPAP
形成钙黏附蛋白连接蛋白复合体,从而介导上皮存在差异,尚需要进行体内动物实验进一步明