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·基础研究·
穿心莲内酯对人骨肉瘤HOS和U2OS细胞株增殖、侵
*
袭、迁移的影响及机制*
柳勋法1,马凤清2**,张翠灵3
(,广东深圳518020;,广东深圳518020;,广
东深圳518020)
[摘要]目的探讨穿心莲内酯(AG)对人骨肉瘤HOS和U2OS细胞株增殖、侵袭及迁移的影响和机制。方
法取对数生长期的人骨肉瘤细胞HOS、U2OS细胞株,分别予不含AG及10、20mmol/LAG处理72h,采用细
胞增殖实验检测各组HOS、U2OS细胞0、24、48及72h的吸光度,采用划痕试验和Transwell法分别检测各组
HOS、U2OS细胞处理48h的迁移能力和侵袭能力,采用Westernblot检测各组HOS、U2OS细胞处理72h的周期
素依赖性激酶4(CDK4)和CDK6蛋白表达。结果20mmol/LAG组HOS、U2OS细胞培养24、48及72h的吸光
度低于不含AG组和10mmol/LAG组,差异均有统计学意义(P<);20mmol/LAG组HOS、U2OS细胞的侵
袭数目及迁移率分别低于不含AG组和10mmol/LAG组,差异均有统计学意义(P<);20mmol/LAG组
HOS、U2OS细胞CDK4、CDK6蛋白水平分别低于不含AG组和10mmol/LAG组,差异均有统计学意义(P<
)。结论AG可抑制人骨肉瘤HOS、U2OS细胞株的增殖、侵袭及迁移能力,其机制可能与调控细胞内
CDK4、CDK6表达有关。
[关键词]细胞增殖;细胞运动;穿心莲内酯;人骨肉瘤;HOS细胞;U2OS细胞;侵袭
[中图分类号]R4[文献标识码]A[文章编号]2096-8388(2022)05-0536-06
DOI:.2096-
Effectsofandrographolideonproliferation,invasion,andmigrationof
humanosteosarcomaHOSandU2OScellsanditsmechanism
LIUXunfa1,MAFengqing2,ZHANGCuiling3
(,ShenzhenPeople'sHospital,Shenzhen518020,Guangdong,China;
ofFamilyPlanning,ShenzhenPeople'sHospital,Shenzhen518020,Guangdong,China;
ClinicalLaboratory,ShenzhenPeople'sHospital,Shenzhen518020,Guangdong,China)
[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheeffectsofandrographolide(AG)onproliferation,invasion
HOSandU2OSinlogarithmicgrowthphaseweretreatedwithno-AGcontaining,10mmol/L,and
20mmol/LAGfor72h,respectively;thecellproliferationexperimentwasadoptedtodetect
absorbanceofHOSandU2OScellstreatedfor0h,24h,48hand72h;scratchtestandTranswell
assaywereadoptedtodetectcellinvasionandmigrationofHOSandU2OScellstreatedfor48h;
WesternblotwaschosentodetectCyclindependentkinase4(CDK4)andCyclindependentkinase6
(CDK6)
cellsin20mmol/LAGgroupculturedfor24h,48h,and72hshowedlowerabsorbancethanthatof
no-AGgroupand10mmol/LAggroup,differenceswerestatisticalsignificance(P<).The
invasivenumberofHOScellsandU2OScellsandthemigrationratein20mmol/LAGgroupwere
significantlylessthanthoseof0mmol/Land10mmol/LAGgroups,differenceswerenotstatistically
**[基金项目]广东省自然科学基金(2018A030313616)
**通信作者E-mail:******@
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5期柳勋法等穿心莲内酯对人骨肉瘤HOS和U2OS细胞株增殖、侵袭、迁移的影响及机制
significant(P<).TheexpressionsofCDK4andCDK6inHOScellsandU2OScellsin20mmol/L
AGgroupwerelessthanthoseinno-AGand10mmol/LAGgroups,respectively,anddifferences
werenotstatisticallysignificant(P<).ConclusionAGcaninhibittheproliferation,invasion,
andmigrationofhumanosteosarcomaHOSandU2OScells,whichmightberelatedtotheregulationof
CDK4andCDK6expression.
[Keywords]cellproliferation;cellmovement;andrographolide(AG);humanosteosarcoma;HOS
cells;U2OScells;invasion
骨肉瘤又称骨癌,是青少年最高发的原发恶性37℃孵育4h,弃上清培养基,加二***亚砜(dimeth-
肿瘤,好发于膝关节周围,其次是肱骨上端,其它部ylsulfoxide,DMSO)150μL/孔,振荡后酶标仪检测。
位也有累及,包括中轴骨都可以发生[1]。
对于骨肉瘤的治疗方案主要是手术联合化疗,但术孔板背后均匀划横线,~,每
后患者肢体功能表现差异较大,且化疗药物的毒副孔至少5条线;取对数生长期HOS、U2OS细胞,接
作用较大,需要探索安全、有效、毒副反应低的治疗种于6孔板,接种密度1×106个/孔,去除培养基;
药物[2]。穿心莲是临床应用广泛的药物,有解毒、每孔加不含AG和10、20mmol/LAG各1mL;枪头
清热、消肿及凉血的作用,已用于泌尿系感染、呼吸垂直于背后横线划痕;磷酸盐缓冲盐溶液(phos-
道感染及湿疹等病症[3]。有研究发现穿心莲的主phatebufferedsaline,PBS)洗涤细胞3次,弃上层悬
要活性成分穿心莲内酯(andrographolide,AG)具有浮细胞,加新的血清培养基,5%CO2、37℃培养箱
较好的抗肿瘤效果,在肺癌、前列腺癌及胶质母细传代培养。
胞瘤的疗效中已被初步证实[4-5],
相关资料较少。故而,本研究探讨了AG对人骨肉长期HOS、U2OS细胞,接种于6孔板,接种密度1
瘤HOS和U2OS细胞株的影响,旨在探索骨肉瘤×106个/孔,去除培养基,每孔加不含AG和10、
治疗的新思路。20mmol/LAG各1mL,培养48h;收集细胞,3000r/
min离心10min,去上清,DSMO培养液重悬,上室
1材料与方法
接种HOS、U2OS细胞5×104个/孔,下室加胎牛血
;取出小室,吸除培养液,甲醛固定,结
、U2OS晶紫染色;PBS洗去浮色后倒置显微镜拍照[6]。
细胞株,购于上海药物所细胞库。
(cyclin-dependentkinase4,CDK4)及CDK6蛋白表
养液(美国Millipore),Westernblot试剂盒及细胞达分别提取CDK4及CDK6细胞总蛋白,蛋白值
核蛋白、总蛋白试剂盒(美国Hyclone),Transwell定量(bicinchoninicacid,BCA)法检测CDK4及
小室试剂盒(北京中杉生物);大鼠抗人磷酸化多CDK6蛋白浓度,取蛋白20μg经十二烷基硫酸钠
克隆抗体(美国BD),辣根过氧化物酶标记羊抗大(sodiumdodecylsulfate,SDS)缓冲液上样混合变性
鼠单克隆抗体(美国R&D),酶标仪(美国GE)。后进行SDS-PAGE胶电泳并切胶、转膜;室温2h
,封闭液弃去,加大鼠抗人磷酸化细胞外调节
、U2OS细胞置于10%蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases,
胎牛血清高糖细胞培养液,5%CO2、37℃条件培养ERK)多克隆抗体作为一抗4℃孵育过夜、洗膜、辣
箱传代培养,细胞贴壁程度达80%~90%后进行根过氧化物酶标记羊抗大鼠IgG二抗孵育后洗膜
传代。进行显色反应,曝光后显影;β-actin为内参蛋白
[7]。
生长期HOS、U2OS细胞,接种于24孔板,
4
度2×10个/孔,每组设3个平行孔;5%CO2、37℃,计量资料采用均数±标
条件培养箱培养,细胞贴壁后每孔加不含AG和准差(x±s)表示,组间比较使用方差分析;P<
10、20mmol/LAG各1mL及5g/LMTT10μL,。
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贵州医科大学学报47卷
48及72h的吸光度低于不含AG组和10mmol/L
2结果
AG组,差异均有统计学意义(P<),可见AG
、U2OS细胞增殖有抑制作用,其呈剂量依
20mmol/LAG组HOS和U2OS细胞培养24、赖性。见表1。
表1AG对两种人骨肉瘤细胞吸光度的影响(x±s)
(x±s)
吸光度
组别
0h24h48h72h
HOS细胞
±±±±
10mmol/±±(1)±(1)±(1)
20mmol/±±(1)(2)±(1)(2)±(1)(2)
<<<
±±±±
不含AG组
10mmol/±±(1)±(1)±(1)
20mmol/±±(1)(2)±(1)(2)±(1)(2)
<<<
注:(1)与同细胞不含AG组比较,P<;(2)与同细胞10mmol/LAG组比较,P<。
20mmol/
少于不含AG组和10mmol/LAG组,差异均有统ofHOSandU2OScells
细胞侵袭数目/个
计学意义(P<)。见表2和图1。组别
HOS细胞U2OS细胞
±±
20mmol/LAG组HOS和U2OS细胞迁移率低
10mmol/±(1)±(1)
于不含AG组和10mmol/LAG组,差异均有统计20mmol/±(1)(2)±(1)(2)
学意义(P<)。见表3。
P<<
注:(1)与不含AG的同细胞株组比较,P<;(2)与10mmol/L
AG的同细胞株组比较,P<。
图1AG对2种人骨肉瘤细胞株侵袭能力的影响(Transwell法,×200)
(Transwell,×200)
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5期柳勋法等穿心莲内酯对人骨肉瘤HOS和U2OS细胞株增殖、侵袭、迁移的影响及机制
表3AG对两种人骨肉瘤细胞株迁移率的影响(x±s)表4AG对两种人骨肉瘤细胞株中CDK4和
(x±s)
HOSandU2OScells(x±s)
细胞迁移率/%levelsofHOSandU2OScells(x±s)
组别
HOS细胞U2OS细胞蛋白表达
组别
±±
HOS细胞
10mmol/±(1)±(1)
±±
20mmol/±(1)(2)±(1)(2)10mmol/±(1)±(1)
(1)(2)(1)(2)
±±
P<<<<
注:(1)与同细胞不含AG组比较,P<;(2)与同细胞10mmol/U2OS细胞
LAG组比较,P<。±±
10mmol/±(1)±(1)
±(1)(2)±(1)(2)
20mmol/LAG组HOS和U2OS细胞CDK4、
CDK6蛋白相对表达量分别低于不含AG组和10P<<
(1)(2)
mmol/LAG组,差异均有统计学意义(P<)。注:与不含AG的同细胞株比较,P<;与10mmol/LAG
的同细胞株比较,P<。
见表4。
图2各组HOS和U2OS细胞中CDK4和CDK6蛋白的表达(Westernblot)
(Westernblot)
发现穿心莲、黄芩、柴胡及大黄等中药均具有抗肿
3讨论瘤效果,其中穿心莲是临床抗肿瘤作用的重要药物
之一,其主要成分AG对于胃癌、肺癌、肝癌等具有
骨肉瘤好发于15~19岁青少年,病情发展迅被证实具有一定疗效[13-14]。但截至目前国内外针
速,几个月就可经血液转移到肺部[8]。既往临床对AG关于骨肉瘤的资料较少且相关机制尚未明
主要是采取截肢保命的方法,5年生存率仅为确。因此本研究探讨了AG对骨肉瘤细胞的疗效
20%。现阶段新辅助化疗及生物医学治疗技术的及生物学行为,旨在为临床骨肉瘤的治疗方案提供
发展也为骨肉瘤的治疗开辟新道路和使得骨肉瘤新的思路。
保肢治疗成为可能,并逐渐在临床取代大部分的截本研究发现20mmol/LAG对HOS、U2OS细
肢术,5年总体生存率也可达到70%左右[9-12]。胞培养24、48及72h的吸光度明显低于不含AG
但化疗因为毒副作用较高等问题,临床应用存在局组和10mmol/LAG组,可见AG对HOS、U2OS细
限性。胞增殖有抑制作用,其呈剂量依赖性。既往研究表
中药较西药具有更低的毒副作用,最新的研究明,AG琥珀酸半酯对W256移植性肿瘤有一定的
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贵州医科大学学报47卷
抑制作用,脱水AG二琥珀酸半酯氢钾制成精氨酸
复盐(简称穿琥氨酸),不论大、中、小剂量对肿瘤4参考文献
细胞均有抑制作用,且随剂量的增加而作用增强,
抑瘤效果确实、稳定[15]。此外,体外实验证明穿心[1]罗成,杨林,-152通过调节AKT-ERK信号
莲对培养的乳腺癌细胞DNA合成有抑制作用[16]。通路对骨肉瘤细胞增殖和迁移的影响[J].现代肿瘤
医学,2019,279(21):13-17.
药物对肿瘤细胞发挥作用主要体现在阻滞细
[2]谭丽清,麦文秀,何文文.***羊霍苷对人骨肉瘤细胞
胞周期,诱导细胞凋亡及抑制细胞的迁移和侵袭并
U2OS增殖、凋亡和迁移的调节作用[J].医学分子生
调节机体免疫功能等方面,因此探索药物对肿瘤细
物学杂志,2019,12(2):131-135.
胞的侵袭和迁移能力能反馈药物的抗癌效果。本
[3]阎亮,孙晓泽,王上增,
研究结果显示20mmol/LAG组HOS、U2OS细胞增殖,迁移和侵袭的影响[J].中国脊柱脊髓杂志,
侵袭数目和细胞迁移率明显少于不含AG组和102019,269(8):51-58.
mmol/LAG组,提示较高浓度AG对HOS、U2OS细[4]
胞侵袭和迁移具有抑制作用,其呈剂量依赖性,因humanosteosarcomaU2OSandHOScellsbysuppression
而AG可能是一种潜在的骨肉瘤治疗药物。药理ofpresenilin1andc-Raf-MEK-ERKpathway[J].Mole-
学研究结果提示,脱水AG琥珀酸半酯对W256移cules,2020,25(2):326.
植性肿瘤有一定的抑制作用,而穿琥氨酸不论大、[5]方硕,余铃,
殖,凋亡,侵袭的影响及机制[J].山东医药,2020,17
中及小剂量对肿瘤细胞均有抑制作用,且随剂量的
(10):45-48.
增加而作用增强,抑瘤效果确实、稳定[17-20],这也
[6]陈田,毛夷冬,马年,
与本研究结果一致。另外,体外研究也表明穿心莲
病毒效果评价[J].中国药师,2019,22(4):47-51.
对培养的乳腺癌细胞DNA合成有抑制作用,因而[7]赵迪,郑允雄,胡钦晓,
AG的抗肿瘤作用可能与抑制癌细胞DNA合成具骨肉瘤U2OS细胞增殖及凋亡的影响[J].中国临床
[21-23]
有密切相关性。药理学杂志,2019,35(18):2113-2115,2138.
CDK4、CDK6均属于周期蛋白依赖性激酶,与[8]YANGJS,LINRC,HSIEHYH,-
细胞周期进程和细胞分裂具有密切相关性,有研究vatestheextrinsicandintrinsicapoptoticprocesses
表明各种CDK沿细胞周期时相交替活化,磷酸化throughJNK1/2andp38pathwaysinhumanosteosarcoma
相应底物,使细胞周期事件有条不紊地进行下cells[J].Molecules,2019,24(18):3280.
[9]李嘉,王磊,
去[24]。因此本研究探讨了AG对CDK4、CDK6蛋
制人骨肉瘤细胞U2OS的增殖[J].解剖科学进展,
白的影响旨在分析AG对骨肉瘤细胞的异常增殖
2019,25(2):142-145.
和分裂的相关机制,结果显示,20mmol/LAG组
[10]LUKH,WUHH,LINRC,
HOS和U2OS细胞CDK4、CDK6蛋白相对表达量L48H37suppresseshumanosteosarcomaU2OSandMG-
均明显少于不含AG组和10mmol/LAG组。上述63cells'migrationandinvasioninculturebyinhibitionof
结果提示AG可能是通过调控CDK4、CDK6表达uPAviatheJAK/STATsignalingpathway[J].Mole-
而抑制人骨肉瘤HOS、U2OS的异常增殖和侵袭。cules,2020,26(1):30.
相关机制研究提示激活的CDK蛋白可将靶蛋白磷[11]MUY,ZHANGL,CHENX,-
酸化而产生相应的生理效应,如将核纤层蛋白磷酸27ainhibitsproliferationandinvasionofhumanosteosar-
化导致核纤层解体、核膜消失,将H1磷酸化导致comacellsthroughtheSFRP1-dependentWnt/β-catenin
染色体的凝缩等等,上述效应的最终结果使细胞周signalingpathway[J].BioscienceReports,2019,39
(6):16-19.
期不断运行[25]。故而AG通过调控CDK4、CDK6
[12]曹亚伟,肖鹏,孙金鹏,
表达激酶和其调节因子能够抑制骨肉瘤细胞的异
Wnt/β-catenin信号通路对骨肉瘤U2OS细胞生物学
常增殖和侵袭。特性的研究[J].中华显微外科杂志,2020,43(2):161
综上所述,AG可抑制人骨肉瘤HOS、U2OS细-166.
胞增殖、侵袭及迁移能力,可能与调控CDK4、[13]SOFÍAJ,HÉCTORA,HEVIAD,-
CDK6表达有关。iclesfromosteosarcomacelllinescontainmiRNAsassoci-
540
5期柳勋法等穿心莲内酯对人骨肉瘤HOS和U2OS细胞株增殖、侵袭、迁移的影响及机制
atedwithcelladhesionandapoptosis[J].Gene,2019,2019,25(2):32-36.
710(17):246-257.[20]MPINGIRIKAEZ,HOSSEINYAE,BAKHEITSMS,
[14]曹飞,康小红,王大峰,,ethyl
链非编码RNA诱导骨肉瘤U2OS细胞侵袭和转移的acetate,andwaterextractsofephedrafoemineaonhuman
机制[J].中华肿瘤杂志,2020,42(12):1007-[J].Bi-
[15]SUNJY,HOUYJ,CUIHJ,-5584inhibitsoMedResearchInternational,2020,19(17):1-16.
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