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47 .
年月47 8
JOURNALOFGUIZHOUMEDICALUNIVERSITY .
2022820228
·基础研究·
缺氧诱导靶向调控肝癌细胞迁移
∗Caveolin-1Vimentin
及侵袭∗
李英,王兴,李永宁,刘鹏,刘松柏,潘耀振∗∗
贵州医科大学临床医学院外科学教研室贵州贵阳
(, 550004)
[摘要]目的探讨小窝蛋白在缺氧诱导的条件下对肝癌细胞迁移和侵袭的影响及分子机制
-1(CAV1)。
方法采用定量聚合酶链反应及蛋白免疫印迹检测肝癌细胞系中的表达选取及细
CAV1,MHCC-97HHep3B
胞经***化钴处理构建体外细胞缺氧模型通过实验测定细胞活力细胞划痕实验检测
(CoCl2),CCK-8,、Transwell
细胞迁移侵袭能力蛋白免疫印迹检测及上皮间质转化相关蛋白钙黏蛋白钙黏蛋白
,CAV1-E-(E-cadherin)、N-
波形蛋白的表达用小干扰下调细胞中的表达分析缺氧条件下对
(N-cadherin)、(Vimentin);RNACAV1,CAV1
细胞迁移侵袭及上皮间质转化的影响免疫共沉淀法分析与在蛋白层面的相互作用
、-;CAV1Vimentin。
结果在肝癌细胞系中高表达选择干预为构建细胞缺氧模型的最佳浓度和作用
CAV1,100μmol/LCoCl224h
时间缺氧环境中表达明显增加P细胞迁移侵袭能力增强P蛋
;CAV1(<),(<);Vimentin、N-cadherin
白表达增加表达降低下调后及细胞的迁移侵袭能力减弱P均
,E-cadherin;CAV1MHCC-97HHep3B、(<
蛋白表达降低的表达增加免疫共沉淀证实与存在互作
),Vimentin、N-cadherin,E-cadherin;CAV1Vimentin
关系结论一定程度的缺氧能促进肝癌细胞的迁移及侵袭能力其机制可能与靶向促进上皮
。 ,CAV1Vimentin
间质转化有关
。
[关键词]肝肿瘤小窝蛋白上皮间质转化缺氧细胞迁移侵袭转移
;-1;;;;;
[中图分类号][文献标识码][文章编号]
A 2096-8388(2022)08-0879-08
DOI
:.2096-
Hypoxia-inducedCaveolin-regulatesmigrationandinvasionof
1
hepatocellularcarcinomacellsviatargetingVimentin
LIYing,WANGXing,LIYongning,LIUPeng,LIUSongbai,PANYaozhen
DepartmentofSurgeryClinicalMedicalCollegeofGuizhouMedicalUniversityGuiyang550004GuizhouChina
(,,,,)
AbstractObjective
[] ToexploretheeffectofCaveolin-1(CAV1)onmigrationandinvasionof
Methods
hepatocellularcarcinoma(HCC)cellsunderhypoxiaanditsmodeofaction. The
expressionlevelsofCAV1inHCCcelllineswereanalyzedbyquantitativereal-timepolymerasechain
reaction(qPCR)-97HandHep3Bwereselectedtoestablish
vitro
-8(CCK-8)

wasappliedtodetecttheexpressionlevelsofCAV1andepithelial-mesenchymaltransformation(EMT)-
relatedproteins,includingE-cadherin,N-cadherin,
expressionbysmallinterferenceRNA(siRNA)onmigration,invasionandEMTunderhypoxiawere
-immunoprecipitation
Results
(Co-IP)assay. CAV1expressionwassignificantlyup-regulatedinmosthepatomacelllines
P
relativetohealthyhumanlivercells(<).Acellularhypoxiamodelwasestablishedbytreating
基金项目国家自然科学基金贵州省科技计划项目黔科合平台人才贵阳市科技计划项目筑科合同
∗∗[]〔2019〕81960535;(〔2018〕5779-29);(〔2018〕1-86)
通信作者
∗∗E-mail:******@
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贵州医科大学学报卷
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cellswithoptimalconcentrationof100μmol/LCoCl2)
PP
upregulatedCAV1expression(<),enhancedcellmigrationandinvasion(<),
increasedtheproteinexpressionlevelsofVimentinandN-cadherinbutdecreasedE-cadherinexpression.
P
SilencingCAV1expressionweakenedmigrationandinvasionofMHCC-97HandHep3Bcells(<
),downregulatedexpressionlevelsofVimentinandN-cadherinbutupregulatedE-cadherin
Conclusion
-IPresultdemonstratedthatCAV1interactedwithVimentin. Hypoxia-
mediatedCAV1atsomeextentcanpromoteHCCcellmigrationandinvasion,anditsmechanismmay
berelatedtopromotingEMTbytargetingVimentin.
Keywords
[]hepatocellularcarcinoma;caveolin-1(CAV1);epithelial-mesenchymaltransformation
(EMT);hypoxia;cellmigration;invasion;metastasis
如何有效防治肝癌的复发及转移是改善肝癌司及转染试剂盒购自锐博生物科技公司
,siRNA,
患者预后提高生存率的关键[1]缺氧是实体肿购自碧云天公司
、。ProteinA+GAgarosebeads,CCK-
瘤微环境的基本特征之一在肿瘤的生长转移放试剂盒购自日本同仁
,、、8。
化疗耐药中发挥重要作用[2-5]缺氧标志物在肝12研究方法
。.

,.
的不良预后[6]缺氧参与恶性肿瘤侵袭转移的胎牛血清及青链霉素双抗的培养
。、10%1%DMEM
一个重要机制就是对肿瘤细胞上皮间质转化基中于的恒温培养箱中常规培
(epi-,37℃、5%CO2
的调节作养取生长状态良好的与细胞
thelial-mesenchymaltransition,EMT)。MHCC-97HHep3B
用[7-8]是由调节因子经过各种信号转导通接种于孔板中个孔待细胞贴壁后更
。EMT96(4000/),,
路导致上皮细胞特性消失而表达间质细胞特性的换为含***化钴
,50、100、150、200、250μmol/L(CoCl2)
细胞转化过程研究证实的发生可促进肝的培养基继续培养对照组不予干预
。,EMT24h,CoCl2,
癌的侵袭及转移[9-10]小窝蛋白采用法检测细胞活力选取
。-1(caveolin-1,CCK-8。100μmol/L
是细胞膜小窝的主要支架蛋分别处理细胞后
CAV1)(caveolae)CoCl20、12、24、48、72h,CCK-8
白参与了细胞增殖信号转导影响了肿瘤的发法检测不同时间下细胞活力酶标仪检测波长为
,、,。
生发展和转移[11-12]其异常表达在多种类型的细胞活力处理组值对照组
、,450nm,(%)=(OD450/
肿瘤中被研究报道特别是在晚期癌症转移灶中表值
,OD450)×100%。
达明显上调[13]
。CAV1. siRNA siRNA(
临床行为和不良预后密切相关在肝癌中已有少数州中国构建合成取生长状态良好的
,、)。MHCC-
研究报道[14-15]然而在缺氧条件下的作和细胞接种于孔板中细胞融合度
。,CAV197HHep3B6,
用机制尚不清楚本研究旨在分析表达与缺达时按照说明书采用转染试剂盒将干扰序
,CAV170%,
氧微环境的关系探讨其对肝癌细胞迁移侵袭能列及干扰对照序列转染
,、(si-CAV1)(si-NC)MHCC-
力的影响及分子机制和细胞后更换培养基后收
。97HHep3B,12h,48h
集细胞用于进一步的实验
。

. qPCR TRIzolRNA,
以逆转录试剂盒进行逆转录以®
cDNA,SYBR

PremixExTaqPCR。
正常肝细胞系及肝癌细胞系置个复孔反应条件
LO2HepG2、5,:95℃30s,95℃5s,60℃
和购自上海生科院扩增个循环数据采用
HCC-9810、MHCC-97HHep3B30s,40。Bio-RadCFXMan-
细胞资源中心培养基胰蛋白酶及软件进行处理结果取平均值进行计算管家
,DMEM、%ager。,
胎牛血清购自公司青霉素链霉素双抗购基因作为内参采用-ΔΔCt计算目的基因
Gibco,-GAPDH,2
自公司及的相对表达量引物序列正向引物
Hyclone,CAV1、Vimentin、E-cadherinN-mRNA。:CAV1
抗体购自武汉三鹰公司抗体购自为反向引物
cadherin,β-actin5′-GCGACCCTAAACACCTCAAC-3′,
公司羊抗鼠及羊抗兔二抗购自博士德生物公为
CST,5′-ATGCCGTCAAAACTGTGTGTC-3′。
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期李英等缺氧诱导靶向调控肝癌细胞迁移及侵袭
8 Caveolin-1Vimentin

. RIPA(10μL、10μL
细胞中的总蛋白行凝胶电泳分及提取总蛋白加入
,10%SDS-PAGEPMSF5μL),20μLProtein
离蛋白湿转将目的蛋白转移至于摇床孵育对蛋白提
,300mA120minA+GAgarosebeads4℃2h,
膜上封闭液室温封闭后分别将目的条取物进行预纯化将纯化后的提取物分为份分
PVDF,2h。3,
带放入对应的一抗溶液中孵育过夜次日洗涤别加入纯化组抗体组留
4℃;IgG(IgG)、CAV1(IP)、
条带后放入羊抗鼠或羊抗兔不加任何抗体作为对照组组于
(1∶2000)(1∶2000)50μL(Input),
二抗中室温孵育采用法对条带进行显摇床孵育过夜组及组孵育后的提
,1h。ECL4℃。IgGCAV1
影以作为内参比较目的蛋白表达取物中各加入
,β-actinCAV1。40μLProteinA+GAgarosebeads,

. 5×10(/)100℃5min,
匀的接种于孔板内细胞融合度达到时用采用蛋白凝胶电泳进行检测分析
6,90%,SDS-PAGE。

,,
用枪头沿着直尺划垂直线用清洗采用和软件对
200μL,
遍后加入无血清培养基立即于倒置实验数据进行分析并绘图计量资料采用均值
2mLDMEM,。±
显微镜下观察并拍照待培养后再观察拍照标准差xs进行描述两组间比较采用t检验
,48h。(±),。

. Transwell <。
化无血清培养基重悬计数按4个孔接
、,2×10(/)
种于未包被或基质胶包被的细胞培养小室2结果
Transwell

,200μL。 CAV1
含胎牛血清的培养基常规CAV及蛋白的表达在
700μL10%DMEM。1mRNAHepG2、HCC-
培养后取出小室用棉签去除滤膜内侧的细等肝癌细胞系中较人正
24h,9810、MHCC-97H、Hep3B
胞加入多聚甲醛固定结晶紫染色常肝细胞中的表达量高P并且在
,4%30min,1%LO2(<),
清洗掉多余的结晶紫染料后烘干显微镜和细胞中的表达最明显见图
30min,,MHCC-97HHep3B。
下观察并拍照故选取及细胞进行后续缺
。1。MHCC-97HHep3B

. 500μLNP40。
()()
注:与比较,1P,2P。
LO2<<
图1 CAV1在肝细胞及肝癌细胞系中的表达
CAV1expressioninhepatocytesandHCCcells

CAV1。100μmol/LCoCl20、12、
以诱导结果显示时细胞的增殖活性最
0、50、100、150、200、250μmol/LCoCl224、48、72h,,24h,
及细胞缺氧实验大P见图故以作用
MHCC-97HHep3B24h,CCK-8(<,2),100μmol/LCoCl2
结果显示时肝癌细胞的生作为细胞缺氧模型的最佳浓度和时间与对
,0~100μmol/LCoCl2,24h,
长无明显影响当浓度高于后照组相比缺氧环境明显促进了蛋白
;150μmol/L,MHCC-(0h),CAV1
及细胞的存活率均有不同程度的下表达见图
97HHep3B。3。
881
贵州医科大学学报卷
47
()()
注:与或比较,1P,2P。
0μmol/L0h<<
图2 缺氧对肝癌细胞增殖活性的影响
EffectofhypoxiaoncellproliferationinHCCcells
图3 缺氧对肝癌细胞中CAV1表达的影响
EffectofhypoxiaonCAV1expressioninHCCcells
、侵袭能力的影响率明显增加P见图实验
(<)。4。Transwell
划痕实验结果示与对照组比较结果示与对照组相比缺氧明显促进了细胞
,(0h),MHCC-,(0h),
及细胞在缺氧环境下细胞的相对迁移迁移和侵袭P见图
97HHep3B(<)。5。
()
注:与比较,1P。
0h<
图4 缺氧对MHCC-97H及Hep3B细胞迁移能力的影响(SP,×200)
EffectofhypoxiaonmigrationofMHCC-97HandHep3Bcells(SP,×200)

EMTCAV1MHCC-97H
结果显示与对照组相比转移能力的影响划痕实验结果示与对
Westernblot,(0h),Hep3B。,
缺氧环境下相关指标蛋照组相比干扰的表达后细胞的相
EMTVimentin、N-cadherin(si-NC),CAV1
白明显增加的表达明显降低P对迁移率明显减弱差异有统计学意义P
,E-cadherin(<,(<
见图见图细胞迁移及侵袭实验结
)。6。)。7。Transwell

CAV1MHCC-97HHep3B,(si-NC),si-CAV1
移、侵袭的调控作用移及侵袭能力明显降低差异有统计学意义P
,(<
采用干扰的表达后进一步验证见图
siRNACAV1,)。8。
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8 Caveolin-1Vimentin
()()
注:与比较,1P,2P。
0h<<
图5 缺氧对MHCC-97H及Hep3B细胞侵袭能力的影响(SP,×200)
EffectofhypoxiaoninvasionofMHCC-97HandHep3Bcells(SP,×200)
图6 缺氧对MHCC-97H及Hep3B细胞中EMT相关指标表达的影响
EffectofhypoxiaontheexpressionlevelsofEMT-relatedproteinsinMHCC-97HandHep3Bcells
()()
注:与相比,1P,2P。
si-NC<<
图7 下调CAV1对MHCC-97H及Hep3B迁移能力的影响(SP,×200)
EffectofsilencingCAV1expressiononmigrationofMHCC-97HandHep3Bcells(SP,×200)
883
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()()
注:与比较,1P,2P。
si-NC<<
图8 下调CAV1对MHCC-97H及Hep3B细胞侵袭能力的影响(SP,×200)
EffectofsilencingCAV1expressiononmigrationandinvasionofMHCC-97HandHep3Bcells(SP,×200)

CAV1EMTHep3BVimentin、N-cadherin
实验结果示缺氧环境下与明显降低表达明显增加P
Westernblot,si-,E-cadherin(<)。
组比较下调表达后及见图
NC,CAV1MHCC-97H9。
图9 下调CAV1对肝癌细胞株MHCC-97H及Hep3B中EMT相关指标的影响
EffectofsilencingCAV1expressionontheexpressionlevelsofEMT-relatedproteins
inMHCC-97HandHep3Bcells

CAV1Vimentin
免疫共沉淀实验显示图在3讨论
(10),MHCC-97H
及细胞中能与在蛋白水平
Hep3B,CAV1Vimentin
存在直接或间接结合的可能性肿瘤细胞转移作为肝癌恶性表型的特征之一
。,
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8 Caveolin-1Vimentin
图10 CAV1与EMT互作关系的验证
VerificationoftheinteractionbetweenCAV1andEMT
提示了肝癌患者的不良预后肿瘤细胞及其微环析促进肝癌细胞迁移及侵袭的分子机制研
。CAV1,
境的相互作用与肿瘤的侵袭转移密切相关[16]究发现干扰表达后明显抑制了
、。CAV1Vimentin、N-
实体肿瘤由于生长过程中肿瘤细胞的快速增殖局的表达而促进了的表达上
、cadherin,E-cadherin。
部微血管形成相对滞后使局部肿瘤组织的血供不述结果表明在缺氧微环境中能调控肝癌细
,,CAV1
足导致肿瘤细胞处于相对缺血缺氧的环境[17]研胞的过程最重要的是本研究通过免疫共
。EMT。,
究表明在缺氧微环境的作用下肿瘤细胞的粘附沉淀实验发现与在蛋白水平存在
,,CAV1Vimentin
能力降低可主动从原发灶脱离侵入间质血管或直接或间接结合的可能
,、。
淋巴系统然后定植在远处组织中形成转移灶[18]综上所述一定程度的缺氧能够促进肝癌细胞
,。,
而该过程受多种调控因子基因和信号通路的调的迁移及侵袭能力其机制可能与的表达水
、,CAV1
控具体机制还有待进一步研究在肺癌结直肠平增加激活途径促进了肝癌细胞的侵袭性
,。、、EMT
癌及胃癌等多种实体瘤中研究发现能促进有关因此可能作为分子靶点之一在肝癌
,CAV1。,CAV1
肿瘤侵袭性药物耐受性抗凋亡等特性[19]本研缺氧微环境调控中发挥重要作用并为下一步探索
、、。,
究结果提示在肝癌中发挥促进细胞迁移及是否可作为预后标志物在临床肿瘤诊断和
CAV1CAV1
侵袭的作用首先及结果显示治疗中发挥价值提供理论基础
。,qPCRWesternblot。
在多株人肝癌细胞系中高表达提示其一定
CAV1,
程度上发挥着促癌作用缺氧微环境已被证明可4 参考文献
。
以选择侵袭性较强的癌细胞在缺氧条件下适应和
生存因此了解与肝癌细胞侵袭性相关的缺氧基
。,[1]BRAYF,FERLAYJ,SOERJOMATARAMI,etal.
因是非常重要的通过构建细胞缺氧模型发现在
。,Globalcancerstatistics2018:GLOBOCANestimatesof
缺氧应激条件下表达进一步增强功能上表incidenceandmortalityworldwidefor36cancersin185
CAV1,
现为促进及细胞的体外迁移和countries[J].CACancerJClin,2018,68(6):394
MHCC-97HHep3B
侵袭能力通过小干扰技术下调的表-424.
。RNACAV1
达后明显抑制了缺氧环境下细胞的迁移及侵袭[2]CHENH,CHENJ,-inducible
,。
上述结果表明缺氧微环境中对肝癌细胞的factor-1α:Acriticaltargetforinhibitingthemetastasisof
CAV1hepatocellularcarcinoma[J].OncolLett,2022,24
迁移及侵袭能力具有重要的调控作用
。(2):284.
近年来被认为是实体肿瘤转移的初始环
EMT[3]ZHAIZS,
节被广泛关注和研究[20]的典型特征是上
,。EMTinhibitingtumormetastasis[J].Journalofpracticaldiag-
皮细胞标志物下调如紧密连接蛋白
,E-cadherin、-1nosisandtherapy,2019,33(2):191-193.
同时伴随间质标志物表达的升高如[4]XUQ,ZHANGYT,-
(ZO-1),,Vim-
且有研究发现肿瘤的缺氧微环ronment-activatedsingle-atomplatinumnanozymewith
entin、N-cadherin;,
境可诱导的发生通过改变能量代谢途径促HOself-supplementandO-evolvingfortumor-specific
EMT,、
进血管形成改变基因表型等方式促进肿瘤细胞适cascadecatalysischemodynamicandchemoradiotherapy
、[J].Theranostics,2022,12(11):5155-5171.
应缺氧促进细胞发生侵袭和转移[21]本研究首
,。
先观察到缺氧条件下肝癌细胞中表达[5]JENABC,MANDALM,Theemergingrolesofexosomesin
E-cadherinanti-cancerdrugresistanceandtumorprogression:anin-
减少和表达增加进一步分
,VimentinN-cadherin。sighttowardstumor-microenvironmentinteraction[J].Bio-
885
贵州医科大学学报卷
47
chimBiophysActaRevCancer,2021,1875(1):188488.[14]ZHANGC,WUQ,HUANGH,-1upreg-
[6]YANGCB,FENGHX,DAICL,Developmentandval-ulatesFut8expressionbyactivatingtheWnt/β-catenin
idationofanimmune-relatedprognosissignatureassociat-pathwaytoenhanceHCCcellproliferativeandinvasivea-
edwithhypoxiaandferroptosisinhepatocellularcarcino-bility[J].CellBiolInt,2020,44(11):2202-2212.
ma[J].CancerMed,2022,11(11):2329-2341.[15]MAAPY,YEUNGCLS,TRYSK,
[7]YANGW,YINY,BIL,-182-5ppromotestheofACADM-mediatedfattyacidoxidationpromotesHepa-
metastasisandepithelial-mesenchymaltransitioninnon-tocellularCarcinomaviaaberrantCAV1/SREBP1signa-
smallcelllungcancerbytargetingEPAS1[J].JCancer,ling[J].CancerRes,2021,81(13):3679-3692.
2021,12(23):7120-7129.[16]RAGHAVANS,WINTERPS,NAVIAAW,-
[8]TAKIM,ABIKOK,UKITAM,-croenvironmentdrivescellstate,plasticity,anddrugre-
croenvironmentduringepithelial-mesenchymaltransitionsponseinpancreaticcancer[J].Cell,2021,184(25):
[J].ClinCancerRes,2021,27(17):4669--.
[9]LINGF,ZHANGH,SUNY,[17]YEJY,HOUB,CHENFM,