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青藤碱对肾癌细胞786-O细胞增殖、细胞周期及凋亡的
影响
谢程国马胜利张镜伟
广州市第一人民医院泌尿外科(广州)
511458
【摘要】目的探讨不同浓度的青藤碱对肾癌细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。方法以不同浓度的青
藤碱处理肾癌细胞,采用四氮唑蓝盐法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期分布,
786-OAnnexin-vFITC/
双染流式细胞分析仪检测细胞凋亡率;采用实时荧光定量及蛋白免疫印迹()检测、、
PIPCRWBc-mycBax
等细胞周期、凋亡相关基因表达情况。结果青藤碱显著抑制细胞的增殖能力,诱导细胞周期
Caspase-3786-O
期阻滞及细胞凋亡;且随着青藤碱浓度的增加,其抑制率也逐渐增加;青藤碱显著下调蛋白表达,而
G1/Sc-myc
诱导凋亡蛋白、表达上调。结论青藤碱可以显著抑制细胞中表达,使其增殖能力减
BaxCaspase-3786-Oc-myc
弱,诱导细胞周期阻滞及凋亡。青藤碱可能具有潜在的抑制肾癌生长作用。
【关键词】肾癌;青藤碱;增殖;细胞周期;凋亡
DOI:
.1000-
Effectsofsinomenineoncellcycleandapoptosisof786-Orenalcarcinomacells
XIEChengguoMAShengliZHANGJingwei
,,
DepartmentofUrologyGuangzhouFirstPeople'sHospitalGuangzhouChina
,,511458,
AbstractObjective
【】Toinvestigatetheeffectsofdifferentconcentrationsofsinomenineonproliferation,cellcycle
Methods
-Orenalcarcinomacells,thecellcycle
changesweredeterminedusingflowcytometry,whilethechangesofapoptosisweredetectedbyAnnexinV-FITC/PIdouble
-relatedproteinssuchasc-myc,BaxandCaspase-3weredetectedbyWesternblot.
Results
Sinomeninesignificantlyinhibitedtheproliferationof786-Ocellsandinducedcellcyclearrestandapoptosisin
G1/,
down-regulatedtheexpressionofc-mycprotein,whiletheexpressionsoftheapoptoticproteinBax,Caspase-3wereup-regula-
Conclusions
-mycin786-Ocells,reduceproliferationability,
.
Keywords
【】renalcancer;sinomenine;proliferation;cellcycle;apoptosis
青藤碱是一种生物碱单体拟探讨青藤碱对人肾癌细胞细胞增殖细
(C19H23NO4),786-O、
从青藤干燥的根和茎中提取[1]多项研究发现青胞周期分部及凋亡的影响以期为防治肾癌提供
。,
藤碱在细胞增殖凋亡转移和血管生成等多种新的理论依据
、、。
生物学过程中发挥着重要作用[2-5]而且越来
。,1材料与方法
越多的研究表明青藤碱具有抗肿瘤作用例如体
,
外实验表明青藤碱能抑制肺癌细胞和材料和试剂
NCI-
白血病细胞的的增殖促进细胞凋亡并增加肿实时荧光定量
,,PCR(real-timefluorescentquan-
瘤细胞对化疗的敏感性[6-7]同时也有抗前列腺扩增和反转录试剂盒均购
,titativePCR,qRT-PCR)
癌作用[8]此外青藤碱还能减少乳腺癌细胞的买于日本公司四氮唑蓝盐
。,Takara;(May-Thumer
迁移和侵袭这些结果阐明了青藤碱在不同肿瘤细胞繁殖定量检测试剂盒购置于
。syndrome,MTS)
中的抗肿瘤作用但是迄今为止青藤碱在肾癌美国公司主要使用的抗体包括
。,Promega;c-myc
细胞中的作用还没有报道因此在本文中我们美国
。,(ab32072,Abcam,),Bax(ab32503,Abcam,
通信作者:谢程国,:
E-******@
美国美国中培养所有细胞在标准细胞培养条件下
),Caspase3(ab32351,Abcam,),。37℃
美国青藤碱购于上湿度生长
GAPDH(ab8245,Abcam,)。(5%CO2,95%)。
海蓝木化工有限公司于实时荧光定量
(Selleck,S2359),
中溶解使其终浓度分别达到取对数生长期细胞采用提取细
100μM、150μM、,Trizol786-O
胞总通过核酸蛋白定量仪
200μM、250μM。RNA,(NanoDrop
细胞培养测定所提取的浓度及纯度然后参
)RNA;,
人肾癌细胞株和正常肾小管细胞照公司的RT试剂盒说
786-OHK-2TakaraPrimescriptReagentKit
购于中国科学院干细胞库细胞在明书将总逆转录成按照
,HK-2Keratino-,RNA(1μg)cDNA;
青霉素和链TM
cyteSerumFreeMedium(K-SFM)+1%PrimeScriptRTMasterMix(PerfectRealTime)
霉素中培养在含有胎牛血清试剂盒说明书以反转录的为模版进行
;786-O10%(Gbico),cDNAPCR
青霉素和链霉素组合的反应所需引物序列如表所示
+1%RPMI1640(Gbico),1:
表1各基因引物序列
基因上游引物下游引物
c-mycGGCTCCTGGCAAAAGGTCACTGCGTAGTTGTGCTGATGT
BaxCCCGAGAGGTCTTTTTCCGAGCCAGCCCATGATGGTTCTGAT
Caspase3CATGGAAGCGAATCAATGGACTCTGTACCAGACCGAGATGTCA
GAPDHCGCTGAGTACGTCGTGGAGTCGCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC
记录各组值并采用公式-ΔΔCT对数据进行染液于冰箱密封避光反应小时最后上
CT2PI4℃1;
处理分析得到各个细胞株中基因的相对表达量机检测根据细胞内各阶段的含量来确定细
,。,DNA
蛋白免疫印迹法胞周期的分布
(Westernblot,WB)。
收集对数生长期细胞加入流式细胞凋亡检测
786-O,1×
裂解细胞经超声离心后去掉其他细利用流式细胞仪检测细胞周期取对数生长期
LysisBuffer,、,
胞成分使用蛋白定量分析试剂盒对提取的细胞胰酶消化使用凋亡检测试剂盒
,BCA,,AnnexinV
蛋白进行定量加入加样缓冲液煮沸按照实验步骤
;5×SDS,APC(Cat:88-8007,ebiosicence),
以使蛋白变性配液的聚丙烯酰双染偶联和碘化
10min;10%SDSAPCAnnexinV(annexinV-APC)
***凝胶进行电泳分离然后转膜封闭并在丙啶使用对
,,,4℃(PI),FACSCalibur(BDBioscience)
与一抗孵育过夜二抗室温孵育小时采用化学细胞进行分析每个样本共采集个细胞使
;2,。20000,
发光法检测目的蛋白表达并进行灰度值分析用软件对数据进行分析
,。BDCellQuest。
细胞增殖实验统计学分析
按照细胞繁殖定量检测试剂盒实验步骤计量资料均采用均数标准差xs表示
MTS,±(★±),
将完全培养基中的个细胞接种到多组间比较采用方差分析组间比较采用两独立t
100μL200096,2
孔板中在和下培养天然后检测利用统计学软件做统计分析取
,37℃5%CO21~5,,,
每个时间点在培养基中加入下孵P作为检验水准以上所有实验均重复次
10μLMTS,37℃<。3。
育后波长下测定每孔吸光度根据结
4h,490nm,2结果
果绘制细胞生长曲线
。
流式细胞周期检测不同浓度青藤碱对肾癌细胞增殖能力
-O
通过流式细胞术检测不同浓度青藤碱对的影响
786-O
细胞周期的分布取对数生长期细胞用清为了探讨青藤碱在肾癌细胞中的生物学作用
。,PBS,
洗遍后加入不含血清的培养基然后我们在细胞培养基中加入不同浓度的青藤碱
3FBS1640,786-O
使用预冷乙醇固定细胞置于过夜第培养基中青藤碱终浓度分别为
75%,4℃;(100、150、200、
二日离心去除乙醇经清洗后加入如图所示与及空白组相
,PBS,100μL250μmol/L)。1,DMSO
于水浴箱中放置然后加比不同浓度青藤碱均明显抑制细胞的增殖
RNaseA,37℃30min;,786-O
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能力且随着浓度的增高其抑制作用愈强结果青藤碱诱导细胞周期期阻滞
,,,-OG1/S
具有统计学意义P我们进一步探讨青藤碱对细胞周期分布的影响
(<)。。
结果如图所示空白组和组细胞期细胞
2,DMSOG1
百分比分别占期细胞百分比
%、%,S
分别占而加入不同浓度青藤碱
%、%,
后期细胞分别增加到
,%(100μmol),
%(150μmol),%(200μmol),
而期细胞减少至
%(250μmol),%
(100μmol),%(150μmol),%(200
说明青藤碱可以诱导
μmol),%(250μmol),
图1不同浓度青藤碱对肾癌细胞增殖能力的影响细胞周期期阻滞
786-O786-OG1/S。
图2青藤碱诱导肾癌细胞周期阻滞
青藤碱诱导细胞凋亡期及凋亡相关蛋白的表达水平结果如图所示
-O。4,
空白组和组晚期凋亡细胞百分比分别青藤碱显著下调蛋白及水平而诱导
DMSOc-mycmRNA,
为而加入不同浓度青藤碱后凋亡蛋白表达上调P
%、%,,Bax、Caspase-3(<)。
凋亡细胞百分比分别增加到
%(100μmol),3讨论
%(150μmol),%(200μmol),%
说明青藤碱可以诱导细胞凋亡近年来肾细胞癌在全球的发病率逐年上升
(250μmol),786-O,,
P见图是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一据统计
(<)。3。。,2017
青藤碱对细胞周期及凋亡相关蛋白表达水平年美国肾细胞癌新发病例例死亡病例
,
的影响例发病率约占***恶性肿瘤的[9]肾
14400,5%。
我们分别用青藤碱处理小管癌起源于肾近端小管细胞透明细胞癌是最常
DMSO、(200μmol),
肾癌细胞与分别检测细胞周见的亚型占转移性肾小管癌的[10]
786-O,qRT-PCRWB,80%~85%。
图3青藤碱诱导细胞凋亡
786-O
图4青藤碱对细胞周期及凋亡相关蛋白表达水平的影响
200μmol
在治疗方面肾细胞癌对放疗和化疗不敏感虽然生物活性碱青藤碱对类风湿性关节炎的临床治疗
,。。
手术切除肿瘤是目前的最佳治疗策略但其术后复有显著的疗效已被广泛报道[15-16]在癌症治疗中
,。,
发率为[11]而且由于肾小细胞癌对放青藤碱对肿瘤的抑制作用也已在多种肿瘤中被发
20%~40%。
化疗有抵抗性因此缺乏有效的术后辅助治疗[12]现它通过介导细胞增殖和凋亡来发挥作用[17]
,。,,
此外缺乏早期诊断肾细胞癌的生化标志物和随访如青藤碱抑制卵巢癌[18]细胞生长能力降低
,,c-myc
资料阻碍了肾细胞癌的及时诊断近些年靶向药和蛋白水平青藤碱有极小的毒副作用
,。CyclinD1。,
物的应用为肾癌的治疗提供了新的解决途径然而因此近年来青藤碱在抗肿瘤中的应用越来越受到科
。
不幸的是随着靶向药物应用时间的延长患者均研工作者们的重视在本研究中我们发现青藤碱
,,。,
会对靶向药物产生耐药加大靶向药物的剂量则会可抑制细胞增殖诱导细胞周期期阻
,786-O,G1/S
产生严重的不良反应严重影响了靶向药物的临床滞促进细胞凋亡青藤碱下调细胞中
,,。786-Oc-
疗效因此我们急需发现新的治疗药物和靶点的表达水平而诱导凋亡相关蛋白和
。,,myc,Bax
以期改善晚期肾癌患者的生存质量及生存时间表达上调这些结果说明青藤碱在肾
。Caspase3。,
目前大量证据表明许多中草药提取物具有癌细胞中发挥抗肿瘤作用
,,。
很强的抗癌能力如穿心莲内酯[13]魔芋[14]等到目前为止已有许多文献报道了青藤碱抗肿
,、。,
青藤碱是从中草药青藤中提炼出来的一种异喹啉类瘤的能力研究表明***尿嘧啶与青藤碱具有显
。,5-
广州医药年月第卷第期
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著的协同作用与***尿嘧啶相比可以抑制
,5-,Lo-aticlocalizationofcommondisease-associatedvariationin
细胞的生长[19]其他一些报告表明青藤碱处
Vo。,regulatoryDNA[J].Science,2012,337(6099):
理的与未处理的细胞相比细胞数量减少1190-1195.
A549,。
有研究者也指出青藤碱触发时间依赖性的细胞毒[10]:roleof
性导致的显著损失细胞生存能力[20]genomicsforthedevelopmentofdisease-basedtherapeu-
,NCIH460。
我们的研究也得出了类似的结论与对照组相比tics[J].GenomeRes,2012,22(11):2089-100.
,,
青藤碱处理后细胞的抑制率明显降低且抑[11]LJUNGBERGB,CAMPBELLSC,CHOIHY,etal.
786-O,Theepidemiologyofrenalcellcarcinoma[J].EurUrol,
制率随青藤碱浓度的增加而增加青藤碱显著下调
。2011,60(4):615-621.
蛋白表达而诱导凋亡蛋白
c-myc,Bax、Caspase-3[12]RATHMELLWK,-
表达上调以上结果表明青藤碱通过诱导
。,786-Onalcellcarcinoma[J].CurrOpinOncol,2010,22
细胞周期期阻滞促进凋亡来提高对肾细胞(3):250-256.
G1/S,鹿蓓蓓傅鹤秀
癌的抑制作用[13],,ERICACHIBOREBADOROKRAH
。等穿心莲内酯对小鼠乳腺癌的抑制作用和机制
,
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