文档介绍：实验七大肠菌群的测定
一实验目的
1、掌握大肠杆菌的鉴定和计数方法
2、巩固无菌操作技术
二大肠杆菌鉴定原理
大肠菌群:一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否染肠道致病菌的可能。
样品中大肠菌群系以100mL(g)检样内大肠菌群最大可能数(MPN)表示。
细菌学检验程序
样品
细菌总数大肠菌群
水样稀释或不稀释
水样稀释或不稀释
第一步------ 初步发酵试验
倾注平板培养(乳糖发酵)
37 ℃ 24小时 37℃ 24小时
菌落计数第二步------ 平板分离培养
(取平均数报告) (转种鉴别培养基)
37℃ 24小时
革兰染色镜检
第三步------- 乳糖复发酵试验
报告结果
三、实验器材
1、恒温培养箱(36℃±1℃)、高压灭菌锅]、天平、灭菌培养皿、试管。
2、培养基及试剂:
乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂平板(EMB)
四、实验步骤——大肠菌群的检测
检品
胆盐乳糖发酵管
伊红美兰平板
大肠杆菌菌落纯培养
乳糖复发酵管(-) 乳糖复发酵管(⊕)
1、检样稀释
①以无菌操作将检样1mL放于含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。
②用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。
③另取1ml灭菌吸管,按上述操作依次作10倍递增稀释液。
④根据食品卫生要求或对检验样品污染情况估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管,每支试管接种1ml。
2. 乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管;1mL及1mL以下者,用单料乳糖发酵管。每一个稀释度接种3管,置36℃±1℃温箱内,培养24h±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产生者,则按下列程续进行。
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36℃±1℃温箱内,培养18h—24h,然后取出,观察菌落形态并做革兰氏染色和证实试验。
在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1—2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36℃±1℃的温箱内培养24h±2h,观察产气情况。
凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌,即报告为大肠菌群阳性。
根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)食品中大肠菌群的MPN 值。
表1 大肠菌群最可能数(MPN)检索表
阳性管数
MPN
100mL(g)
95%可信限
1mL(g)×3
(g) ×3
(g) × 3
下限
上限
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
2
3
<30
30
60
90
<5
90
0
0
0
0
1
1
1
1
0
1
2
3
30
60
90
120
<5
130
0
0
0
0
2
2
2
2
0
1
2
3
60
90
120
160
0
0
0
0
3
3
3
3
0
1
2
3
90
130
160
190
1
1
1
1
0
0
0
0
0
1
2
3
40
70
110
150
<5
10
200
210
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
2
3
70
110
150
190
10
30
230
360
1
1
1
1
2
2
2
2
0
1
2
3
110
150
200
240
30
360
1
1
1
1
3
3
3
3
0
1
2
3
160
200
240
290