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PCR的基本步骤及注意
(DNApolymeraseI)最早于1955年发现,而较具有实验价值及实用性的Klenow
,但由于此酶不耐高温,高温能使之变性,因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taqpolymerase),则是于1976年从温泉中的(Thermusaquaticus)分离出来的。它的特性就在于能耐高温,是一个很理想的酶,但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似修复复制,。他发表了第一个单纯且短暂复制(类似PCR前两个周期反应)的实验。,,因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。。此后,PCR的运用一日千里,相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用,成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年化学奖。
PCR原理
DNA的是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性成单链,在DNA聚合酶的参与下,根据复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,加入设计,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。
发现耐热DNA聚合酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩扩增放大几百万倍。
[PCR反应体系与反应条件]
10×扩增缓冲液 10μl
4种dNTP混合物 200μl
引物 10~100μl
模板DNA ~2μg
TaqDNA聚合酶 μl
Mg2+ L
加双或三蒸水 100μl
PCR反应五要素:参加PCR反应的物质主要有五种即:
引物(PCR引物为DN***段,细胞内DNA复制的引物为一段RNA链)、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2+)。
引物有多种设计方法,与PCR在实验中的目的决定。但基本原则相同
PCR所用的酶主要有两种来源:Taq和Pfu。分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。所以实际使用时根据需要必须做不同的选择
模板即扩增用的DNA,可以是任何来源,但有两个原则,第一纯度必须较高,第二浓度不能太高以免抑制
缓冲液的成分最为复杂,除水外一般包括四个有效成分:缓冲体系,一般使用HEPES或MOPS缓冲体系;一价阳离子,一般采用钾离子,但在特殊情况下也可使用铵根离子;二价阳离子,即镁离子,根据反应体系确定,除特殊情况外不需调整;辅助成分,常见的有DMSO、甘油等,主要用来保持酶的活性和帮助DNA接触缠绕结构
2、PCR引物设计
PCR反应中有两条引物,即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准(常以信息链为基准),5′端引物与位于待扩增片段5′端上游的一小段DNA序列相同;3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。
引物设计的基本原则
①引物长度:15-30bp,常用为20bp左右。
②引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或的成串排列。
③引物内部不应出现互补序列。
④两个引物之间不应存在互补序列,尤其是避免3′端的互补重叠。
⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%,引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列,否则易导致非特异性扩增。
⑥引物3‘端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,最佳选择是G和C。
⑦引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点,引入突变位点,用生物素、荧光物质、***标记,加入其它短序列,包括起始密码子、终止密码子等。
v引物设计软件
Primer(自动搜索)*
vOligo6(引物评价)
vVectorNTISuit
vDNAsis
vOmiga
vDNAstar
vPrimer3(在线服务)
3、模板的制备
PCR的模板可以是DNA,也可以是RNA。
模板的取材主要依据PCR的扩增对象,可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。
标本处理的基本要求是除去杂质,并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌,可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA,经酚、***仿抽提纯化,再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。
4、PCR反应条件的控制
①PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子
②镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高,常用L
③底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制,20~200umol/L
④TaqDNA聚合酶(100ul)
⑤引物浓度一般为~L
⑥反应温度和循环次数
变性温度和时间95℃,30s
退火温度和时间低于引物Tm值5℃左右,一般在45~55℃
延伸温度和时间72℃,1min/kb(10kb内)
Tm值=4(G+C)+2(A+T)
循环次数:一般为25~30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低,可增加循环数以便达到有效的
扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右,循环数超过30个以后,DNA聚合酶活性逐渐达到饱和,产物的量不再随循环数的增加而增加,出现了所谓的“平台期”。
[PCR步骤]
标准的PCR过程分为三步:
变性
(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA
(25℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。
(70℃-75℃):在(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′端延伸,合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍。
现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度。
PCR检测
PCR反应扩增出了高的拷贝数,下一步检测就成了关键。荧光素(,)染色是最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的,因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行,成为了主流检测方法。近年来以为代表的检测方法,有逐渐取代电泳法的趋势。
PCR反应特点
特异性强
PCR反应的特异性决定因素为:
①引物与模板DNA特异正确的结合;
②碱基配对原则;
③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性;
④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高。
灵敏度高
PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU();在细菌学中最小检出率为3个细菌。
简便、快速
PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2~4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低
不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。
PCR的循环参数
1、预变性(Initialdenaturation)
.
模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要,建议加热时间参考试剂说明书,一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。
2、循环中的变性步骤
循环中一般95℃,30秒足以使各种靶DNA序列完全变性,可能的情况下可缩短该步骤时间
变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不彻底,易造成扩增失败。
3、引物退火(Primerannealing)
退火温度需要从多方面去决定,一般根据引物的Tm值为参考,根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。
退火温度对PCR的特异性有较大影响。
4、引物延伸
引物延伸一般在72℃进行(Taq酶最适温度)。但在扩增长度较短且退火温度较高时,本步骤可省略
延伸时间随扩增片段长短而定,一般推荐在1000bp以上,含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。
5、循环数
大多数PCR含25-40循环,过多易产生非特异扩增。
6、最后延伸
在最后一个循环后,反应在72℃维持5-,并使单链产物退火成双链。
(四)PCR中的污染和假阳性
PCR中污染主要来自
1、样品间交叉污染;
2、先前PCR产物遗留(carry-over)