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CN43-1509/R2022506805
白亮王宝太高志峰等靶向调控肝癌细胞凋亡中南医学科学杂志
,,,.miR-580-3pCOL11A1[J].,2022,50(6):805-808,882.
:·消化系统肿瘤·
.43-1509/
靶向调控肝癌细胞凋亡
miR-580-3pCOL11A1
白亮,王宝太,高志峰,蒋安,梁金强
(西安交通大学第二附属医院普外科,陕西省西安市)
710004
[关键词];;肝癌;细胞凋亡;通路
miR-580-3pCOL11A1PI3K/Akt
[摘要]目的探究靶向调控肝癌细胞凋亡的机制。方法纳入肝细胞癌()患者
miR-580-3pCOL11A1HCC
例,实时荧光定量检测肝癌组织、癌旁组织、人正常肝细胞(、)和人肝癌细胞系(、
42PCRLO2QSG-7701HepG2Huh-
、、)中和表达水平。过表达和敲低后,法检测肝癌细
7Li-7SK-Hep-1COL11A1mRNAmiR-580-3pmiR-580-3pCCK8
胞增殖水平,流式细胞术检测细胞的凋亡水平和细胞周期。免疫印迹分析肝癌关键通路在
Akt/PI3KmiR-580-3p
中的作用。结果与癌旁组织比较,肝癌组织表达升高,表达降低;与人正常肝细胞系
COL11A1mRNAmiR-580-3p
比较,人肝癌细胞系表达降低、表达升高(P)。与表
miR-580-3pCOL11A1mRNA<-580-3p
达呈负相关(P)。过表达后,人肝癌细胞的增殖水平、降低,凋亡率升高;
<-580-3pCOL11A1mRNAmiR-
敲低后上述趋势反之,细胞周期停滞在期。人肝癌细胞凋亡率过表达后降低,敲低后升高。
580-3pG1/SCOL11A1
、表达在敲低或过表达后降低,过表达或敲低后升高。结
p-Aktp-PI3KCOL11A1miR-580-3pCOL11A1miR-580-3p
论肝癌细胞和肝癌组织表达水平降低,轴可能通过调控通路影响肝
miR-580-3pmiR-580-3p/COL11A1PI3K/Akt
癌细胞凋亡。
[中图分类号][文献标识码]
miR--ptargetsCOLAtoregulateapoptosisinhepatocellularcarcinomacells
5803111
BAILiang,WANGBaotai,GAOZhifeng,JIANGAn,LIANGJinqiang
DepartmentofGeneralSurgerytheSecondAffiliatedHospitalofXi'anJiaotongUniversityXi'anShaanxiChina
(,,710004,,)
KEYWORDS
[]miR-580-3p;COL11A1;livercancer;apoptosis;PI3K/Aktpathway
ABSTRACTAim
[]ToinvestigatethemechanismofmiR-580-3ptargetingCOL11A1toregulateapoptosisinhepa-
Methods
-twoHCCpatientswereincluded,TheexpressionlevelsofCOL11A1mR-
NAandmiR-5803-3pinhepatocellularcarcinoma(HCC)tissues,adjacenttissues,humannormalhepatocytes(LO2,
QSG-7701)andhumanhepatocellularcarcinomacelllines(HepG2,Huh-7,Li-7,SK-Hep-1)weredetectedbyreal-time
-580--580-3p,the
proliferationlevelofhepatocellularcarcinomacellswasdetectedbyCCK8assay,andtheapoptosislevelandcellcyclewere
Results
-580-3pwasanalyzedbyWesternblotting.
COL11A1mRNAexpressionwaselevatedandmiR-580-3pexpressionlevelwasdecreasedinHCCtissuescomparedwith
paraneoplastictissues;miR-580-3pexpressionwasdecreasedandCOL11A1mRNAexpressionwasincreasedinhuman
P
hepatocellularcarcinomacelllinescomparedwithhumannormalhepatocellularlines(<).COL11A1mRNAand
P
miR-580-3pexpressionwerenegativelycorrelated(<).AftermiR-580-3poverexpression,theproliferationlevel,
COL11A1mRNAdecreasedandapoptosisrateincreasedinhumanhepatocellularcarcinomacells;aftermiR-580-3pknock-
down,theabovetrendwasreversedandthecellcyclestalledinG1/-
-Aktandp-PI3Kexpressionde-
creasedafterknockdownofCOL11A1oroverexpressionofmiR-580-3pandincreasedafteroverexpressionofCOL11A1or
Conclusion
knockdownofmiR-580--580-3pexpressionlevelwasreducedinhepatocellularcarcinoma
cellsandhepatocellularcarcinomatissues,andthemiR-580-3p/COL11A1axismayaffectapoptosisinhepatocellularcarci-
nomacellsbyregulatingthePI3K/Aktpathway.
[收稿日期][修回日期]
2021-12-072022-09-21
[基金项目]陕西省社会发展科技攻关项目资助
(2016SF-318)
[作者简介]白亮硕士主治医师研究方向为胃肠道肿瘤的诊治为通信作者王宝太硕士主
,,,,E-******@。,,
任医师研究方向为胃肠道肿瘤的诊治为
,,E-******@。
806ISSN2095-1116MedicalScienceJournalofCentralSouthChina,Vol50,No6,2022
肝细胞癌为临加入人肝癌细胞系培养板孔中,转染后更换为
(hepatocellularcarcinoma,HCC)12h
床常见恶性肿瘤主要采用肝切除术和原位肝移植正常培养基培养。
,
治疗方案极易发生转移和复发远期预后并检测和表达
,HCC,-PCRmiR-580-3pCOL11A1mRNA
不理想因此探讨基于分子网络靶点抑制肿瘤细采用提取总,反转录为。
。,TRIzolRNAcDNART-
胞增殖迁移是解决肝癌术后复发的关键研究发条件:;,,
、。PCR95℃2min95℃15s60℃45s72℃
现通过与的非编码区共个循环。采用和为内参基
,miRNAmRNA3'-(3'-un-45s45U6GAPDH
结合可靶向调控蛋白表因,用相对定量法计算基因表达量。引物序列
translatedregion,3'-UTR),GAP-
达和功能与肿瘤的发生转移复发密切相:,:
,miRNA、、DH-F5'-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3'R5'-AC
关[1]表达与乳腺癌细胞和骨肉瘤细胞的;:
。miR-580ACCATGTATTCCGGGTCAAT-3'U6-F5'-GAGGGCC
生长密切相关其表达水平提高能明显抑制两种肿,:
,TATTTCCCATGATT-3'R5'-TAATTAGAATTAATTT
瘤细胞的生长并且降低晚期肿瘤的临床分级[2];:
,。GACT-3'COL11A1-F5'-ACCCTCGCATTGACCTTC
可充当致癌基因或肿瘤抑制基因调,:;
miRNAHCC,C-3'R5'-TTTGTGCAAAATCCCGTTGTTT-3'miR-
控肝癌发生的始动因素或者下游靶点例如:,:
,miRNA-580-3p-F5'-GACTATCGGGACATGTTA-3'R5'-GC
[3-4]提示。
342-3p、miRNA-15a-3p、miRNA-140,miRNAAGGGTCCGAGGTATTC-3'
能够作为肝癌防治的靶点但尤其是流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期
,miR-580miR-
对肝癌细胞增殖凋亡等的作用尚不完全明转染后,收集各组贴壁细胞。用洗涤细
580-3p、48hPBS
确因此本文对此进行了研究胞次,将、和缓冲液按比
,,。3Annexin-V-FITCPIHEPES
例配制成染料溶液()用
Annexin-V-FITC/PI1∶2∶50
于凋亡细胞的染色,用缓冲液清洗后,流式
材料和方法HEPES
1细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。将人肝癌细胞
主要仪器和试剂系、、、消化并固定在冰冷
-7Li-7SK-Hep-1
试剂购自广州捷华生物科技有限公司;乙醇中,过夜,碘化丙啶室温下黑暗中孵育
TRIzol75%4℃
合成试剂盒购自江苏康为世纪生物科技股份,流式细胞术检测细胞周期。实验重复次。
cDNA30min3
有限公司;购自北京斯科科免疫印迹法检测、、、、
-Aktp-
技有限公司;购蛋白
TaqMan®UniversalPCRMasterMixPI3K
自昆明皇宝商贸有限公司;试剂盒购自青岛科提取总蛋白,用试剂盒测定蛋白水平。
BCABCA30μg
创天地生物科技有限公司;细胞凋总蛋白通过聚丙烯酰***凝胶电泳分离,恒压
Annexin-V-FITC80V
亡检测试剂盒购自公司;细胞,。将凝胶蛋白转移到膜
BiovisionHEK-293T35min120V45minPVDF
购自上海朝瑞生物科技有限公司;转染试剂购自广上,脱脂牛奶室温封闭。、、
5%1hCOL11A1Akt
州一科生物科技有限公司;()、、、、抗体稀释后加入膜上,
siRNACOL11A1PI3Kp-Aktp-PI3KGAPDH
过表达质粒、和孵育过夜。缓冲液(含
COL11A1miR-580-3pinhibitormiR-4℃%Tween-20
均由北京擎科设计和合成。缓冲液)洗膜次,用标记的二抗室温孵
580-3pmimicsCCK-8PBS3HRP
试剂盒购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。育。采用化学发光法显色条带,定量灰度值。
1h
组织和细胞法检测细胞增殖
纳入年月—年月本院例法检测细胞增殖水平(细胞活力)。相应
201962021642CCK8
手术患者的肝癌组织及癌旁组织。所有患者处理后,将人肝癌细胞系、、、
HCCHepG2Huh-7Li-7SK-
术前均未接受放疗或化疗,均自愿参与本研究。本接种在孔板培养、、天。然后加入
Hep-196123
研究获得了本院伦理委员会批准。人正常肝细胞试剂,孵育后通过酶标仪测定处
CCK-82h450nm
、和人肝癌细胞系、、光密度(),计算细胞活力。细胞活力实验组或
LO2QSG-7701HepG2Huh-7Li-OD=
、细胞系均购自普诺赛公司,在含胎对照组处空白孔处。
7SK-Hep-110%450nmOD-450nmOD
牛血清的培养基、培养至荧光素酶报告实验
RPMI-16405%CO237℃
生长期。分别将(敲低组)、区域的序列从肝癌细胞系
siCOL11A1COL11A1COL11A13'UTR
过表达质粒(过表达组)、的中进行扩增。将产物克隆到
COL11A1COL11A1miR-HepG2cDNAPCR
(敲低组)和荧光素酶载体中,构建野生型
580-3pinhibitormiR-580-3pmiR-580-3ppmirGLOCOL11A1-3'
(过表达组)与转染试剂混合后和突变型载体。然后
mimicsmiR-580-3pUTR-WTCOL11A1-3'UTR-MT
中南医学科学杂志年第卷第期
CN43-1509/R2022506807
将荧光素酶报告载体与每个质粒共转染到
HEK-结果
细胞中,以海肾荧光素酶表达载体为2
293TpRL-TK
内参。使用的各组和表达的比较
PromegaDigital--580-3pCOL11A1mRNA
检查双荧光素酶活性。与癌旁组织比较肝癌组织表
AssaySystem,COL11A1mRNA
统计学分析达升高表达降低与人正常肝细胞系比
、miR-580-3p;
采用软件进行统计学处理。两组比较人肝癌细胞系表达降低
,miR-580-3p、COL11A1
较采用t检验,多组比较采用单因素方差分析,采用表达升高P图相关性分
mRNA(<;1)。Spearman
相关性分析,P为差异具有统计学析发现肝癌组织中表达与
Spearman<,COL11A1mRNAmiR-
意义。表达呈负相关rP
580-3p(=-,<)。
图1肝癌组织与癌旁组织、人肝癌细胞系与人正常肝细胞COL11A1和miR-580-3p表达的比较
为P与癌旁组织或人正常肝细胞系或比较
a<,LO2QSG-7701。
过表达或敲低后肝癌细胞增殖、人肝癌细胞系凋亡率过表达后
-580-);miR-580-3p
凋亡、细胞周期的比较升高敲低后降低P敲低
,miR-580-3p(<);miR-
与对照组比较人肝癌细胞系增殖水平过表达能够诱导人肝癌细胞在细胞周期停滞
,580-3pG1/S
后降低敲低后升高PP图
miR-580-3p,miR-580-3p(<(<;2)。
图2过表达或敲低miR-580-3p后肝癌细胞增殖、凋亡、细胞周期的比较
为P与对照组比较
a<,。
通过靶向抑制调控肝癌凋亡率上升P图人肝癌细胞系凋亡率过
-580-3pCOL11A1(<,3)。
细胞凋亡表达后降低敲低后上升人肝
COL11A1,COL11A1;
通过数据库在线分析发现癌细胞水平过表达后降
miRBase,miR-580-3pCOL11A1mRNAmiR-580-3p
具有多个潜在靶基因敲低时细胞低敲低后升高P图
,COL11A1HepG2,miR-580-3p(<;3)。
808ISSN2095-1116MedicalScienceJournalofCentralSouthChina,Vol50,No6,2022
图3miR-580-3p通过靶向抑制COL11A1调控肝癌细胞的凋亡
为P与对照组比较
a<,。
和参与介导和凋亡提示肝癌细胞中水平降低是肝
-580-3p/COL11A1,miR-580-3p
的生物学效应癌发生的一个始动因素
。
肝癌细胞中水平在过如上文所述水平降低可能是肝癌发
p-Akt、p-PI3KCOL11A1,miR-580-3p
表达和敲低后显著升高而总生的一个始动因素那么是通过下游什
miR-580-3p,Akt、PI3K,miR-580-3p
表达保持不变肝癌细胞中水平在么途径发挥作用的呢既往研究指出是
;p-Akt、p-PI3K?,COL11A1
敲低或过表达后降低而总肝癌细胞增殖过程中的一个下游调控分子肝癌细胞
COL11A1miR-580-3p,,
水平不变图表达水平是升高的[10]这与本文结果类似
Akt、PI3K(4)。COL11A1,。
那么是否是的一个调控靶点
,COL11A1miR-580-3p
呢本研究发现是的一个调
?,COL11A1miR-580-3p
控靶点过表达后人肝癌细胞系
;miR-580-3p,
水平降低敲低后人肝
COL11A1mRNA;miR-580-3p,
癌细胞系水平升高因此
COL11A1mRNA。,miR-580-
可以靶向调控的表达进一步研究发
3pCOL11A1。
现过表达后人肝癌细胞凋亡率降低相
,COL11A1;
反敲低后人肝癌细胞凋亡率上升以上
,COL11A1。
结果提示可以通过的表达发
图4Akt和PI3K参与miR-580-3p/COL11A1,miR-580-3pCOL11A1
挥抗肝癌细胞增殖和促进肝癌细胞凋亡作用
介导的生物学效应。
有研究已发现与多种实体瘤包括
,COL11A1(
肺癌中的癌症迁移有关[11]且有望成为有效的非
),
讨论小细胞肺癌诊断标志物[12-13]然而在肝癌中尚无
3,
是第五大侵袭性癌症已成为全球癌症相相关研究本研究发现敲低能
HCC,COL11A1。COL11A1
关死亡的第三大原因[5]但只有少数早期确诊的病够抑制肝癌细胞凋亡并且的抗肿瘤功
,,miR-580-3p
例能够通过手术切除或肝移植治愈[6]大多数患者能能够通过介导那么和
,COL11A1。,COL11A1
会因肿瘤复发或远处转移而发展为晚期疾病导致的表达水平变化能否反映肝癌的进程
,miR-580-3p
生存率低[7]基于小分子网络靶点探索抑制肿瘤发还需要进一步探究
。。
生和转移可能成为肝癌的防治靶点因此本文探究除了和在肝癌细胞中的
,,miR-580-3pCOL11A1
了和在肝癌发生中的作用生物学作用外本研究还评估了其潜在的作用机
miR-580-3pCOL11A1。,
是一种小的非编码单链[8]可以在制据报道是的下游介质而
miRNARNA,。,PI3K/AktCOL11A1,
转录后水平抑制靶基因表达在肿瘤发生和转移中抑制剂具有逆转卵巢癌细胞中的顺铂耐药性的
,Akt
充当肿瘤抑制因子或启动因子[9]本研究发现与功能[14-15]与既往研究一致本研究发现在肝癌
。,。,,
癌旁组织比较肝癌组织中表达下调细胞中敲低或过表达后
,miR-580-3p。COL11A1miR-580-3p,p-
与人正常肝细胞系比较人肝癌细胞系和的表达均显著降低据此推测
,miR-580-3pAktp-PI3K。,miR-
表达下调提示可能在肝癌的发生中发和可能是的潜在治疗靶点
,miR-580-3p580-3pCOL11A1HCC。
挥重要作用随后本研究发现过表达综上所述肝癌细胞和肝癌组织中
。,miR-580-3p,miR-580-3p
后人肝癌细胞系增殖降低凋亡率升高相反的表达水平降低轴可能通
,,。,,miR-580-3p/COL11A1
敲低后人肝癌细胞增殖升高凋亡率过调控通路影响肝癌细胞的凋亡
miR-580-3p,,PI3K/Akt。
降低细胞周期停滞在期因此本研究发现(下转第页)
,G1/S。,882
可以调控细胞周期参与肝癌细胞增殖
miR-580-3p
882ISSN2095-1116MedicalScienceJournalofCentralSouthChina,Vol50,No6,2022
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