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ﺴĿỢȷˣԍꞡꞆệՄڄﭲꞫǥ
ﺴPCGF1⸖ꞆệՄ
曾银珍1,樊嵘2
1南方医科大学南方医院麻醉科,广东广州510515;2天津市西青医院中心实验室,天津300380
摘要:目的探讨PCGF1在直肠腺癌中的表达及增殖的调控作用。方法采用UALCAN和ENCORI数据库在线分析PCGF1在
直肠腺癌组织和正常组织中的表达丰度,以及与直肠腺癌临床病理参数以及生存预后的相关性。通过qPCR和Westernblot方
法检测直肠腺癌细胞株和正常细胞株PCGF1表达水平。采用慢病毒载体分别构建PCGF1过表达和沉默稳定转染细胞系,将细
胞分为未转染、过表达和沉默组,通过CCK-8法检测细胞增殖能力。裸鼠成瘤实验检测PCGF1对体内肿瘤增殖的影响。结果
PCGF1在直肠腺癌组织中呈现高表达(P<),PCGF1表达与直肠腺癌分期、组织分化及淋巴结是否转移有关(P<),且
PCGF1高表达的直肠腺癌患者预后更差(P<)。SW837和SW1463细胞中PCGF1沉默组细胞增殖能力降低(P<),且
PCGF1沉默明显抑制直肠癌细胞在裸鼠体内的增殖(P<)。结论PCGF1在直肠腺癌组织中高表达,可能是直肠腺癌患者
生存及预后的标志分子和潜在治疗靶标。
关键词:多梳家族;PCGF1;直肠腺癌;增殖;生存预后
PCGF1ishighlyexpressedinrectaladenocarcinomaandsilencingPCGF1inhibits
proliferationofrectaladenocarcinomacellsinvitro
ZENGYinzhen1,FANRong2
1DepartmentofAnesthesiology,NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2CentralLaboratory,Tianjin
XiqingHospital,Tianjin300380,China
Abstract:ObjectiveToinvestigatetheexpressionofPCGF1inrectaladenocarcinoma(READ)andtheeffectofPCGF1
expressionlevelofPCGF1inREADtissuesandnormaltissuesanditsassociationwiththeclinicopathologicalparametersand
rectalepithelialcellline(HcoEpiCcells)-
overexpressingandPCGF1-silencedcelllines,andtheproliferativeactivityofthecellswasassessedusingCCK-
effectofPCGF1silencingontumorproliferationinvivowasalsoevaluatedbyobservingtumorigenicityofthecellsinnude
(P<),anditsexpressionlevelswascorrelatedwithREAD
stage,differentiationandlymphnodemetastasis(P<).AhighPCGF1expressionlevelwasassociatedwithapoorsurvival
outcomeofREADpatients(P<).InSW837andSW1463cells,PCGF1silencingsignificantlyloweredtheproliferative
activityofthecellsbothinvitro(P<)andinnudemice(P<).ConclusionPCGF1ishighlyexpressedinREADtissueand
maypotentiallyserveasaprognosticbiomarkeraswellasatherapeutictargetforREAD.
Keywords:polycombgroup;PCGF1;rectaladenocarcinoma;proliferation;survivaloutcomes
直肠腺癌(READ)起源于直肠粘膜上皮细胞,是最胖、年龄、遗传、炎症性肠病和辐射等[3]。但READ发生
常见的直肠癌类型,占直肠癌90%以上,且男性发病率发展的分子机制尚未明确。
高于女性[1,2]。虽然现在结肠镜检被作为早期发现和诊多梳家族(PcG)蛋白在胚胎发育和干细胞特性维
断直肠癌的重要手段,但在诊断直肠癌时,约80%是局持中发挥重要作用[4-6],研究表明多梳家族蛋白功能失调
限性的,而20%已经发生远处转移,复发仍然是威胁患与肿瘤发生发展密切相关[7,8]。Bmi-1作为多梳家族明
者健康和困扰医务工作者的难题。研究发现,READ的星分子,在包括卵巢癌、结肠癌、胰腺癌等肿瘤组织中过
病因包括不良饮食****惯、烟草、久坐不动的生活方式、肥表达或者失调[9-11]。多梳家族因子1(PCGF1)在神经系
统发育过程中高度表达,且对细胞的自我更新和胚胎发
收稿日期:2022-05-05育发挥重要作用[12,13]。基因序列分析表明,PCGF1在结
基金项目:国家自然科学基金(81201757);天津市卫健委中医中西医结合构上与Bmi-1高度相似,RINGfinger结构域与Bmi-1
项目();天津市应用基础研究多元化投入基金重点项目
20210312021相应区域同源性高达93%,提示这两个蛋白可能具有相
(21JCZDJC01070)
似的功能。有研究表明,PCGF1在胶质瘤、急性淋巴细
SupportedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina(81201757).
[]
作者简介:曾银珍,主治医师,E-mail:******@-16,但在直肠腺癌中
通信作者:樊嵘,博士,副教授,E-mail:prosperity_******@,因此了解PCGF1在READ调控中的功
-,2022,42(9):1296-1302·1297·
能可能会为其治疗提供一个新的靶点。质粒(本实验室保存)共转染293FT细胞,6~8h后更换
本研究采用生物信息学方法分析PCGF1在直肠腺新鲜培养基,、72h收集上清
℃
癌中的表达情况,探讨PCGF1表达与直肠癌患者的生液,加入病毒浓缩液后4离心获得高滴度慢病毒浓缩
存预后相关性,并进一步通过沉默和过表达PCGF1基液。PCGF1过表达载体引物,Forward:5'-GGAATTC
因的双向操作,探讨对直肠腺癌细胞体内外增殖的影ATGGCGTCTCCTCAGGGGGGC-3',Reverse:5'-CG
响,旨在为PCGF1作为READ诊断标志物、治疗靶标和CGGATCCCTACCTCCTCTTCTCTTTCACACTG-3';
预后评价指标等提供理论依据。PCGF1沉默载体引物,Forward:5'-CACCGGCAGGA
CATCGTGTATAAGC-3',Reverse:5'-AAACGCAGGA
1材料和方法CATCGTGTATAAGCC-3'。
分别采用在线资源ENCORI(,按
)和UALCAN(×105/孔的比例提前1d铺至6孔板,将制备的慢病毒
edu)分析来自TCGA的肿瘤样本数据。其中,UALCAN浓缩液分别感染细胞,12h后更换为新鲜培养基,继续
μ
用于分析直肠癌样本中PCGF1基因表达水平,包括与培养72h。加入终浓度为2g/mL的嘌呤霉素进行筛选。1
μ
不同分型、不同分期、组织亚型、性别、种族、淋巴结转移周后挑选单克隆细胞集落更换至24孔板用1g/mL浓度
等相关的基因表达丰度[17]。本研究通过ENCORI[18]分的嘌呤霉素继续培养,待细胞长满后进行有限稀释筛
μ
析PCGF1基因表达与READ患者生存率的关系。根据选。消化细胞后稀释至100mL,取1L加入预先放入
μ
基因表达的中位数将患者分为高表达组(n=79)和低表99L10%FBS-DMEM培养基的96孔板中继续培养,
μ
达组(n=80)。嘌呤霉素浓度为1g/mL,待细胞长满后移至6孔板进
。SW837NC和SW1463NC分别代表阴性
人胚肾细胞(293FT),人直肠腺癌细胞系对照细胞。
(SW1463,SW837)
℃
(HCoEpiC)由本实验室保存。所有细胞在37、5%用RIPA裂解液(R0010,Solarbio)对细胞进行裂
™
条件下,含胎牛血清()的培养基中解,同时加入蛋白酶抑制剂(
CO210%FBSDMEMcOmpleteProtease
培养。InhibitorCocktail)。用12%SDS-PAGE进行电泳分离
μ
、。5%脱脂牛奶室温下封
℃β
使用TRIzol试剂(Invitrogen)从细胞中分离总闭1h,一抗按照1∶1000稀释4孵育过夜(PCGF1、-
RNA,根据操作说明检测PCGF1mRNA表达水平。然actin,Abcam),洗膜后分别于HRP标记的羊抗兔和羊
后使用PrimeScriptTMRT试剂盒(Takara)进行逆转录。抗鼠抗体(1∶5000,BioRad,Hercules)室温孵育1h。利
qRT-PCR反应采用SYBRGreenPCR试剂盒(Takara)。用ECLPlus(AmershamPharmaciaBiotech)进行化学
GAPDH作为内参对照。反应在ABI®7500FastReal-发光法显色。
TimePCR体系(AppliedBiosystems)中进行。-8法检测细胞增殖
℃℃℃
件为9510min,9515s40个循环,6035s。分析将细胞提前1d种至96孔板,浓度为8×103/孔,
每个样品的熔化曲线。使用2-ΔΔCt方法计算每个重复的CCK-8法检测细胞增殖情况。使用全波长酶标仪于
均值来计算的相对表达量。实验独立重复波长下读取每个孔的吸光值,实验重复次。
mRNA3450nmA450nm3
次。PCGF1引物,Forward:5'-
CCTCAGG-3',Reverse:5'-AGTGGCTGTGTCTCGT雄性BALB/c裸鼠(4~6周龄,n=18)(中国医学科学
℃
GGAT-3';GAPDH引物,Forward:5'-CGCTCTCTGCT院实验动物研究所),饲养在无菌环境中,24和50%~
CCTCCTGTTC-3',Reverse:5'-ATCCGTTGACTCCG70%湿度条件下,12/12h的光/暗循环,并允许自由获得
ACCTTCAC-3'。食物和水。所有动物实验均经本院动物伦理委员会批
。将裸鼠随机分为对照组(NC)、过表达组(OE)和敲
将PCGF1全长序列克隆到pLVX-IRES-Puro载体低组(KD),6只/组。分别将SW837-NC、SW837-OE和
中(Overexpression,OE),同时针对PCGF1敲除靶点设SW837-KD细胞(6×106/mL)重悬于100μLPBS溶液
计引物并克隆到pLVX-shRNA2载体中(Knockdown,中,注射入裸鼠左侧腋下皮下组织。1d/次测肿瘤长径
KD),进行慢病毒包装。将293FT细胞按照5×104/mL和短径,计算肿瘤体积,以每组动物移植肿瘤体积的均
提前1d铺种至6孔板,分别将构建的载体与PMD和SPA值绘制生长曲线。裸鼠麻醉后拍照,完整剥离肿瘤,称
·1298·JSouthMedUniv,2022,42(9):1296-1302-
取移植瘤质量、测量肿瘤体积,拍照后固定于中***尔两组间比较采用Student'st检验,多组间比较采用单因
马林液中固定后进行组织学检测。素方差分析。P<。所有实
&E染色验均独立重复3次。
肿瘤组织在10%甲醛中固定、包埋后制作成4μm
切片,经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水,蒸馏水洗涤5min,2结果
用苏木素对组织进行染色15min。然后置于1%
醇溶液中分化30s,%伊红染料溶液复染5minUALCAN在线分析TCGA数据库中PCGF1在
(G1120,Solarbio),梯度乙醇浸泡脱水封片。所有操作READ组织中的表达水平发现,PCGF1在READ组织
均在室温下进行。中的表达高于正常对照组织(P<,图1A)。
肿瘤组织在10%甲醛中固定、包埋后制作成4μm和直肠粘液腺癌之间的差异均有统计学意义(图1B)。
切片,经脱蜡、脱水、抗原修复和封闭。与Ki67抗体不同病理分期READ组织中PCGF1表达均高于正常对
(IHC-R098,IBP)4孵育过夜,然后室温下与二抗照组(P<),并且Ⅳ期直肠腺癌组织PCGF1表达高
(SE134羊抗兔,Solarbio)孵育1h。加入DAB显色于Ⅰ期组织(图1C)。不同淋巴结转移的READ组织中
(DA1010,Solarbio),孵育30s。光学显微镜下观察染PCGF1表达与正常对照组相比,差异同样具有统计学
色效果。意义(图1D)。对PCGF1表达与READ患者总生存率
,PCGF1表达高于平均值,且与OS
。对符合实验下降显著相关(HR=,P=,图1E)。
条件的样品进行了分析,定量资料以均数±标准差表示,
A35****B40C50
****
35****
30***40
30
25#***********
2530
20
2020
1515
10
1010
rncitprmillionperTranscript
rncitprmillionperTranscript
rncitprmillionperTranscript
550
NormalPrimarytumorNormalAdenocarcinomaMucinousNormalStage1Stage2Stage3Stage4
adenocarcinoma
(n=41)(n=286)(n=41)(n=243)(n=37)(n=41)(n=45)(n=110)(n=80)(n=39)
D40E
35********Low
****High
(low,1)
(high,1)
25
15
10survivalPercent
rncitprmillionperTranscript
NromalN0N1N2
050100
(n=41)(n=156)(n=70)(n=47)
Survival(month)
图1PCGF1在直肠腺癌组织中表达
::Expressionof
::
:AnalysisofPCGF1expressionand
survivalrateofREADpatients.#P<:Stage1vsStage4;***P<;****P<.
为验证上述生物信息学预测分析结果,我们对人正照细胞(P<,图2A)。
mRNA水平和蛋白水平进行了比较。结果显示肿瘤细我们采用双向操作技术,分别构建PCGF1过表达
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A15
**B
HCoEpicSW837SW1463
4**
3PCGF1
2
1β-actin
0
HCoEpicSW837SW1463
eaiemNeefPCGFoflevelmRNARelative
图2PCGF1在正常和直肠癌细胞中表达
:Expression
:ExpressionofPCGF1protein.**P<.
和沉默的慢病毒载体,%%(图3),将该细胞系作为后续实
胞,转染后挑选单克隆,建立稳定转染细胞系。对建立验的基础细胞系,按照过表达和沉默分别命名为OE和
的细胞系进行Westernblot分析,证实过表达和沉默细KD细胞,对照细胞为NC细胞。
胞系均构建成功,且SW837和SW1463细胞沉默效率
ASW837NCSW837OESW837KDBSW1463NCSW1463OESW1463KD
PCGF1PCGF1
β-actinβ-actin
*******
********
-actin)
-actin)
β
/
/
1
0
nestai(PCGFratioIntensity0
nestai(PCGFratioIntensitySW837NCSW837OESW837KDSW1463NCSW1463OESW1463KD
图3PCGF1过表达和沉默细胞系构建
-overexpressingandPCGF1-,C:PCGF1
,D:PCGF1overexpressionandsilencingin
SW1463cells.***P<.****P<
。结果显示,与NC和OE组相比,KD组肿瘤体积和
CCK-8实验结果显示,与NC细胞相比,SW837质量缩小(图5A),且在荷瘤期间,KD组肿瘤生长明显
KD细胞和SW1463KD细胞生长速度显著降低(P<,慢于NC组和OE组,相应的肿瘤体积也较小(P<,
图4),而PCGF1过表达则对细胞增殖没有明显作用。图5B)。对3组肿瘤重量进行分析,结果显示KD组的
(P<),而NC组和OE组之间
鉴于PCGF1可以在体外抑制READ细胞增殖,我没有显著性差异(图5C)。同时,小鼠体质量变化无统
们进一步通过裸鼠成瘤实验鉴定PCGF1在体内的作计学意义(P>,图5D)。在H&E和免疫组化实验
·1300·JSouthMedUniv,2022,42(9):1296-1302-
SW837KDSW1463OE
####
nm####
450
450
A
#****##****
*****
#
****
00
1234512345
Culturetime(d)Culturetime(d)
图4PCGF1沉默对READ细胞增殖的影响
(A)andSW1463cells(B)detectedby
CCK-8assay.*P<.**P<.****P<;#P<.##P<.####P<.
B1500
A
)
3NC
1000OE
KD
CON
500
OE####
######
uooun(mmvolumnTumor#****
****
*********
KD0
68101214161820222426
Inoculationtime(d)
D20
C3**
19
NC
OE
2&&
18KD
117
oywih(g)weightBody
uoegt(g)weightTumor
016
NCOEKD1234
Inoculationtime(d)
图5PCGF1基因不同表达水平对裸鼠体内肿瘤生长的影响
:Tumorsizeofnude
miceineachgroup(n=6).B:::Animalbodyweight.**P<,***P<,
****P<,KDgroupvsNCgroup;#P<,###P<,####P<,OEgroupvsNCgroup;&&P<,KDgroup
vsOEgroup.
中,肿瘤细胞增殖通过Ki-67染色检测,结果显示KD组性维持上具有重要作用[21],而且该作用主要与表观遗传
肿瘤组织中Ki-67阳性细胞数低于对照组(P<),而调控有关。众所周知,肿瘤发生和进展中的表观遗传异
NC组和OE组的差异无统计学意义(P>,图6)。常已经被证实可以引起肿瘤的所有特征表型[22,23]。PcG
蛋白的功能失调,无论是功能获得还是功能缺失,都会
3讨论导致表观遗传的限制或者促进,引发错误的下游效应,
研究发现PCGF1主要在神经系统中表达,并且进而诱发肿瘤的特征。截止目前,多项研究已经证实包
PCGF1缺失的胚胎干细胞会出现严重的外胚层和中胚括PCGF1在内的多个PcG蛋白在实体瘤和血液系统恶
层发育缺陷[20]。本课题组在以往对小鼠畸胎瘤细胞P19性肿瘤等多种肿瘤中显著升高,并促进肿瘤进展。Bmi-1
细胞的研究中发现,PCGF1可以直接与Oct4启动子结作为PCGF1高度同源的PcG家族蛋白,在大肠癌中表
合维持P19细胞的多能性,提示PCGF1在干细胞多能达明显升高,其与大肠癌发生、转移及预后密切相关,且
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NCOEKD
H&E
67
Ki
图6PCGF1基因不同表达水平肿瘤组织标本免疫组化分析
andknockdown(Originalmagnification:×200).
对Ki67的表达具有间接调控作用,在结直肠癌肝转移究PCGF1对直肠腺癌调控的分子机制,我们采用经典
小鼠模型中,敲除Bmi-1可以减少肝转移,而过表达双向操作方法,分别构建PCGF1基因过表达和敲低的
Bmi-1则增加肝转移[24,25]。Mel18(PCGF2)通过抑制慢病毒载体,选取293T为包装工具细胞,并利用嘌呤霉
reg3b和STAT3信号通路的表达,促进结肠腺瘤细胞素对目的细胞进行筛选,挑选单克隆细胞进一步扩大培
增殖,减少细胞凋亡,参与小鼠结肠炎相关肿瘤的发生养,最后获得稳定过表达和沉默的直肠癌细胞模型,经
发展[26]。免疫印迹实验验证两种细胞的PCGF1沉默效率均大于
PCGF1在宫颈癌、胶质瘤等肿瘤组织及细胞模型70%。通常情况下,肿瘤细胞增殖能力明显发生改变,
中表达水平升高也提示其可能发挥重要调控作用[14-16]。而且与肿瘤放化疗抗性及复发密切相关。因此,我们利
裸鼠成瘤实验证实,在具有更高克隆形成能力的侧群细用该细胞系重点分析PCGF1在调控细胞增殖方面的作
胞(SP)中,PCGF1表达水平更高[27]。PCGF1过表达可用。CCK-8实验是经典检测细胞增殖能力的实验,结果
以增加HeLa细胞和SH-SY5Y细胞S周期细胞分布,降证实PCGF1沉默导致细胞增殖能力显著下降,而
低G2/M期细胞比率[14]。本课题组以往的研究也证实,PCGF1过表达则对细胞增殖能力没有明显作用。不仅
PCGF1沉默后可以抑制c-Myc信号通路,进而抑制胶如此,我们通过裸鼠成瘤实验发现,PCGF1沉默后明显
质瘤细胞增殖[16]。随着研究的不断深入,PCGF1作为转抑制肿瘤细胞在动物体内的增殖和生长,同样PCGF1
录抑制因子在肿瘤细胞中的调控功能逐渐被挖掘出过表达没有改变肿瘤生长速度和体积。因此,体内外实
来[11,28]。有研究证实,PCGF1可以直接与p21Waf1/Cip1验均提示PCGF1是直肠腺癌细胞增殖的关键基因,这
启动子区结合,从而抑制p21Waf1/Cip1表达和促进细为PCGF1可能是一个有希望的治疗靶点,可以用来抑
胞周期进展,而p21是肿瘤细胞生长周期进程的关键负制体内结直肠癌的生长提供了有力证据。有趣的是,有
调控因子[29-31]。PCGF1在干细胞样胶质瘤细胞中高度研究发现PCGF1结合于结肠癌干细胞标志物的启动子
表达,且PCGF1敲低后干细胞标志物表达下调,细胞的上,并且通过增加KMT2A表达和减少KDM6A表达,
神经球形成和自我更新能力下降,皮下异种移植物增殖分别促进H3K4组蛋白三***化和减少K3K27组蛋白
能力下降,而PCGF1