文档介绍：酶联免疫实验
实验目的
掌握ELISA方法的原理和类型
熟练ELISA方法检测乙肝五项操作
ELISA的原理
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活又保留酶的活性。
在测定,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应,用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开;再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上。再次洗涤此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度。
用于临床检验的ELISA主要 有以下几种类型:
1 双抗体夹心法测抗原
2 双抗原夹心法测抗体 3 间接法测抗体 间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗 体)
4 竞争法测抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多,结合在固相上的酶标抗原愈少,最后的显色也愈浅。
小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。
5 捕获包被法测抗体
实验材料
。
“两对半”的ELISA试剂盒: (1)已包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂) (2)酶标记的抗原或抗体(结合物)
(3)洗涤液 (4)酶反应终止液 (5)酶的底物、显色剂 (6)阴性对照品和阳性对照品
、温浴箱
实验步骤
(1) 取出包被孔,编号。各孔分别加入待测血清50μl。(阴阳性对照每板做一个)
(2)每孔加入酶结合物50μl,用不干胶封孔后。
(3)在微型振荡器上震荡30秒,使孔内液体混合均匀(该步骤很重要),然后 37℃水浴30min。
(4)弃去孔内液体,用洗涤液注满每孔,弃去,反复6次;最后在吸水纸上拍干。
(5)每孔加底物、显色剂各一滴,37℃孵育10min
(6)加终止液一滴(约50μl),终止反应观察结果。
非竞争法 目测法以显色孔为阳性;比色法是以吸光度A值>(阳性对照值)为阳性,标本吸光度A值≤ 竞争法 结果观察需反看:目测法以不显色(无色)孔为阳性;比色法是以吸光度A值>(阴性对照值)为阴性,标本吸光度A值≤。
结果判断: