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·1744·2022Nov11
网络出版时间::网络出版地址::
2022-09-150756https//.
EFHD2蛋白的缺失对小鼠Sertoli细胞紧密连接蛋白的影响
叶晓林1胥国麟1钱体军2秦凤2王云涛1程煜航3赵文珍1
,,,,,,
摘要目的研究手域蛋白在小鼠睾丸内细胞蛋白表达降低后蛋白表达也
EF-D2(EFHD2)Sertoli。EFHD2,Occludin
的定位及表达及蛋白在细胞中的缺失对紧减少结论蛋白在睾丸组织中表达量相对较高
,EFHD2Sertoli。EFHD2,
密连接蛋白组分的影响方法取成年小鼠心主要分布于睾丸细胞中与波形蛋白共定位且能影
Occludin。、Sertoli,,
肝脾肺肾脑及睾丸组织提取总和蛋白质运用响紧密连接蛋白的正常表达提示能促进
、、、、RNA,Occludin。EFHD2
和检测在各器官组织中和维持细胞的细胞连接结构为精子发生提供一个稳
qRT-PCRWesternblotEFHD2mR-Sertoli,
和蛋白质水平的差异性运用免疫荧光和免疫组化技术定的微环境
NA;,。
检测在睾丸组织中的定位和表达运用干扰关键词手域蛋白睾丸细胞蛋白
EFHD2。siRNAEF-D2;;Sertoli;Occludin;
技术降低细胞中EFHD2来检测蛋白的表波形蛋白精子发生
SertoliOccludin;
达结果显示EFHD2在睾丸中表达量最高
。qRT-PCR;中图分类号

Westernblot;文献标志码文章编号
疫荧光和免疫组化结果显示该蛋白主要分布在细胞A1000-1492(2022)11-1744-06
Sertoli
内与细胞骨架波形蛋白具有共定位即明确该蛋白表达在doi:.issn1000-
,,
属于手域家族成员是一个
接收EFHD2EF-,
2022-06-06大小的高度保守的蛋白质由一个低复杂性的带有
基金项目国家自然科学基金编号云南省科技厅科技
:(:82160280);,
计划项目编号丙氨酸延伸的末端区域一个功能性结合基
(:202101BA070001-041、202101BA070001-N-、SH3
序两个功能性手结构域和一个末端螺旋结
108、202001BA070001-084)、EF-C-
作者单位大理大学基础医学院1组织学与胚胎学教研室2病原与
:、构域组成研究显示其功能为一种调节因子能够
媒介生物研究所大理。,
,671000调节肌动蛋白构成细胞骨架参与成核作用同时调
3大理大学级临床医学专业大理,,
2018,671000节细胞的扩散和迁移[1-2]还参与内吞和囊泡运
作者简介叶晓林男硕士研究生
:,,;,
赵文珍女教授硕士生导师责任作者输[3-4]目前在神经系统疾病和肿瘤细胞
,,,,,E-mail:zwz6565。EFHD2
迁移方面的研究较多主要是涉及信号传导及细胞
***@,
wereusedtotreatSH-SY5Ycellsfor24h,andthenCellCountingKit-8(CCK-8)assaywasusedtoscreenthe
proliferationabilityofSH-SY5Ycells;SH-SY5YcellsweretreatedwithNaFanddifferentconcentrationsof2-BFI
(,,,,)for24h,andtheproliferationabilityofSH-SY5Ycellswasdetectedby
CCK-,themito-
chondrialfunctionwasdetectedbyATPdetectionkitandMito-TrackerRedCMXRoskit,cellapoptosiswasdetec-
tedbyTUNELstaining,andtheexpressionsofBcl-2,Bax,andcleavedcaspase-3proteinweredetectedbyWest-
Results
-SY5YgraduallydecreasedwiththeincreaseofNaFconcentration.
-,
thecellsurvivalratewashigher(%),and10mmol/Lwasselectedasthe2-BFIfollow-upexperimental
,themitochondrialmorphologyoftheNaFgroupchanged,ATPlev-
elsandmitochondrialmembranepotential(Δψm)decreased,theapoptosisrateincreased,Bcl-2proteincontent
decreased,expressionofBaxandcleavedcaspase-,2-BFIadminis-
trationimprovedmitochondriamorphology,increasedATPlevelsandΔψm,reducedcellapoptosisrate,increased
Conclusion
Bcl-2proteincontent,andreducedBax,cleavedcaspase--BFIcanimprove
mitochondrialmorphologyandfunction,reducecellapoptosis,andplayneuroprotectiveroleinfluorosisSH-SY5Y
cells.
Keywords
fluorosis;2-BFI;SH-SY5Y;mitochondriaapoptosis
安徽医科大学学报ActaUniversitatisMedicinalisAnhui;57()
2022Nov11·1745·
骨架蛋白相关推测能够调节肌动蛋白的表1qRT-PCR涉及引物序列
。EFHD2
引物名称引物序列
捆绑影响细胞骨架参与的细胞内吞和囊泡运输为(5′-3′)
,β-actin
细胞的细胞连接的清除和形成提供协助该F:AGCCATGTACGTAGCCATCC
Sertoli。R:GCTGTGGTGGTGAAGCTGTA
研究主要探讨蛋白的缺失对细胞连EFHD2
EFHD2SertoliF:CAGGGATGGCTTCATCGACC
接蛋白成分的影响R:CACCTCCTGGATCATACTCTTGA
。GAPDH
F:TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT
材料与方法
1R:CCTCGTCCCGTAGACAAAATG
11仪器荧光显微镜日本奥林巴斯公
.(BX53,表2siRNA干扰序列
司成像系统伯乐生命医学引物名称引物序列
),Bio-Rad(Bio-RadXR,(5′-3′)
产品上海有限公司实时荧光定量仪
),PCRmEFHD2-731F:GCAGCGGAAAGCGGCCUUUAATT
美国应用生物系统公司伯乐垂直R:UUAAAGGCCGCUUUCCGCUGCTT
(SteponePlus,),
电泳转印系统TM基础电泳仪电源mEFHD2-474F:GACGAGGAUUUCGACAGCAAATT
(Bio-RadPowerPac
小型垂直电泳转印槽伯乐生命医学产品R:UUUGCUGUCGAAAUCCUCGUCTT
1645050、,mEFHD2-308F:GUUCAAGGAGUUCUCCAGGAATT
上海有限公司
)。R:UUCCUGGAGAACUCCUUGAACTT
12主要试剂艾博抗上海贸易有限公司
.():An-
抗体抗体产物在实时荧光定量仪上进行定量扩
ti-EFHD2(ab106667),Anti-VimentincDNAPCR
抗体辣根过氧增每种组织为EFHD2及内参β-actin各重复次
(ab8978),Anti-Occludin(ab167161),,3。
化物酶标记的山羊抗兔二抗并对产物进行琼脂糖凝胶电泳用-ΔΔCT法
(HRP)IgG(ab6728),qPCR。2
标记的山羊抗兔分析实验数据计算表达水平
AlexaFluor488IgG(ab150113),,mRNA。
标记的山羊抗鼠143法检测在各组织中的
AlexaFluor594IgG(ab150116)。..WesternblotEFHD2
兰杰柯科技有限公司缓冲液蛋白表达水平分别取只小鼠心肝脾肺肾
Biosharp:PBS5、、、、、
缓冲液翌圣生物科技脑睾丸卵巢等组织各取加入
(BL601A)、TBS(BL602A)。、、,50mg1mlRIPA
上海股份有限公司裂解液用玻璃研磨器研磨组织抽提蛋白经
():HieffqPCRSYBRGreenMas-,,。
电泳转膜封闭孵育一抗
terMix(11202ES08)、HifairIII1stStrandcDNASyn-SDS-PAGE、、5%BSA2h,
碘化丙啶过夜洗膜次重复
thesisKit(11139ES10)、(40711ES10)。(1∶1000,4℃),TBST10min/,3
试剂TM转染次孵育二抗室温使用化学
TRIzol(15596026)、Lipofectamine2000,(1∶20000,1h),ECL
试剂美国赛默飞世尔科技公司组织裂解发光试剂发光成像系统拍照使用
()。RIPA,Bio-Rad。Image
液上海碧云天生物技术有限公司进行灰度分析对灰度值进行统计学分析
(P0013B,)。Anti-J,。
抗体赛信通上海生物试剂有限公144免疫酶检测在睾丸组织的表达取
β-actin(#4970,..EFHD2
司只小鼠睾丸组织经液固定石蜡包埋切
)。5Bouin’s、、
13实验动物及细胞只级雄鼠片抗原修复打孔封
.15SPFc57,10、、%TritonX-100、5%BSA
周龄体质量购自大理大学实验动物中闭一抗孵育过夜二抗孵
,(20±2)g,、(1∶500)4℃,(1∶1000)
心于温度湿度环境中饲育试剂显色苏木精复染光镜观察
。22~26℃、40%~60%1h,DAB,,EF-
养自由饮食饮水细胞即正常小鼠在睾丸中的定位和分布情况并且拍照
,、。TM4SertoliHD2,。
细胞获赠于上海交通大学刘悦老师145间接免疫荧光检测在睾丸组织中与
,。..EFHD2
14方法共定位情况取新鲜睾丸组织进行冰冻切
.Vimentin
141引物设计运用软件设计片***固定打孔
..Oligo7qRT-PCR。15min,%TritonX-100,5%
所需引物引物序列见表的由生封闭一部分切片一抗过夜二
,1。EFHD2siRNABSA,(1∶500)4℃。
工生物工程上海股份有限公司代设计序列见表抗孵育染色荧光显微镜下观察该
(),(1∶1000)2h,PI
并且引物也一并由该公司合成蛋白在睾丸组织中的分布并且拍照另一部分切片
2,。。
142检测EFHD2在各器官组织中进行抗体和抗体双染
..qRT-PCRmR-Anti-EFHD2Anti-Vimentin
水平的表达分别取只小鼠心肝脾肺色镜下观察和共定位情况
NA5、、、、,EFHD2Vimentin。
肾脑睾丸等组织用手持均质器研磨组织采用146脂质体转染法递送进入细胞
、、,,..siRNATM4
法提取各组织总反转录成并对细胞接种于孔板设置个组空白对照
TRIzolRNA,cDNA,TM46。5,
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·1746·2022Nov11
组阴性对照组个干扰序列组待细胞融合度到
、、3。
时使用TM试剂转染
40%,Lipofectamine2000siRNA,
终浓度为转染时使用
siRNA30nmol/L。24h,TR-
试剂提取细胞总并逆转录为
IzolRNAcDNA。48h
时使用裂解液提取蛋白
RIPA。
147检测干扰后各组EFHD2相对表
..qRT-PCR
达量提取各组细胞的总后逆转录成
RNA,cD-
接着进行随后运用-ΔΔCT法分析实验
NA,qPCR。,2
数据计算表达水平
,mRNA。
148检测干扰细胞
..WesternblotsiRNATM448h
的和的相对表达量提取后的细
EFHD2Occludin
胞蛋白经电泳转膜封闭
,SDS-PAGE、、5%BSA2h,
孵育一抗过夜洗膜
(1∶1000,4℃),TBST10min/
次重复次孵育二抗室温
,3,(1∶20000,1h),ECL
化学发光试剂发光成像系统拍照用
,Bio-Rad。Im-
进行灰度分析对灰度值进行统计学分析
ageJ,。
15统计学处理使用软件进图1小鼠各组织中EFHD2的相对表达量(A)
.GraphPadPrism9
行数据分析两组之间运用检验结果值以表与qPCR后电泳结果(B)
tx■s
,,±心肝脾肺肾脑睾丸
示以P为差异有统计学意义a:;b:;c:;d:;e:;f:;g:;EFHD2:100bp;
。<。与肝脏组织比较∗∗∗P
GAPDH:133bp;:<
2结果

示EFHD2在小鼠心肝脾肺肾脑和睾丸等器
:、、、、、
官组织中均有不同程度的表达肝和脑中表达量较
,
其他组织高在睾丸中最高图差异有统计学
,(1A),
意义P对产物进行琼脂糖凝胶电
(<)。qPCR
泳结果说明扩增具有特异性图
,qPCR(1B)。

验结果显示蛋白在小鼠心肝脾肺肾
:EFHD2、、、、、
脑和睾丸组织中均有表达在肝脏脑和睾丸组织中
,、
表达量较高图
(2)。

定位情况用免疫组化技术检测蛋白在睾
EFHD2
丸组织中的分布情况结果显示细胞的胞质
,:Sertoli
周边着色较深而生精细胞和睾丸间质细胞着色较
,
浅这表明蛋白主要分布于细胞
。EFHD2Sertoli
图图2Westernblot法检测各器官组织中EFHD2蛋白的表达
(3)。
心肝脾肺肾脑睾丸与肝组织比
:;B:;C:;D:;E:;F:;G:;
较∗∗P
况对小鼠睾丸组织进一步进行间接免疫荧光检:<
测结果和免疫酶标记的检测结果一致荧光在确实是在细胞表达的图
,,Ser-EFHD2Sertoli(4)。

toli,EFHD2Sertoli
细胞此外还采取了与免疫荧光共定位对表达量在进行干扰后对携带绿色荧光蛋白
。,Vimentin6h,
检测结果显示和细胞特的阴性对照序列进行转染效率观察图
,:EFHD2Vimentin(Sertoli(GFP)(5),
异性蛋白在细胞中荧光染色重叠验证可以观察到已成功将转染进细胞对
)Sertoli,siRNATM4。
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图3免疫酶技术检测EFHD2在小鼠睾丸中的定位情况
在小鼠睾丸中的定位不加一抗的对照组
A、B:EFHD2;C:;A、C:×200;B:×400
图4间接免疫荧光技术检测结果
在小鼠睾丸中的表达情况和在小鼠睾丸中共定位情况
A:EFHD2×400;B:EFHD2Vimentin×400
检测结果进行统计学分析结果显示图过各种细胞连接来调节生精细胞的各种状态
qRT-PCR,(Sertoli
空白对照组和阴性对照组EFHD2相对表达量细胞底部和基膜相连构成血睾屏障
5B),,(blood-testis
相近两组比较差异无统计学意义的一部分的完整为精子发生提
,。mEFHD2-308barrier,BTB)。BTB
与阴性对照组比较表达下降差异有统计学意义P供一个稳定的微环境血睾屏障的不完整将会影响
,(,
精子的发生[5]细胞连接中的紧密连接锚定连接
<)。。、
-和桥粒连接是的主要组成成分[6]并且细胞
BTB。,
cludin的相对表达量结果显示图连接周期性的清除和形成是生精细胞向生精小管管
Westernblot(
的蛋白表达量较其他组下腔运动的基础[7]细胞连接的清除可以让生精细
6),mEFHD2-308EFHD2。
将较明显差异有统计学意义P进一胞分裂和向管腔运动细胞连接形成后生精细胞接
,(<)。,,
步检测紧密连接蛋白成分的相对表达量收细胞提供的营养物质进行物质合成为下
Occludin,Sertoli,
空白对照组和阴性对照组差异无统计学意义同样个细胞周期做准备细胞的稳态是正常生精
;。Sertoli
是的下降较其他组明显差异有统计的基础细胞的细胞连接调控涉及多个方
mEFHD2-308,。Sertoli
学意义P面其中细胞骨架成分如微丝微管中间丝及其
(<)。。,、、
相关的波形蛋白等多种蛋白可通过支
3讨论(Vimentin),
持黏附信号传导等方式促进和维持的连接结
、、SC
细胞与生精细胞有着各种细胞连接通构[8-9]细胞连接结构的清除和形成依赖支持细胞
Sertoli,。
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·1748·2022Nov11
图5siRNA转染效率及各组EFHD2相对表达量
×100
空白对照组阴性对照组组
A:;B:;C:mEFHD2-731;D:
组组与阴性对照组比较
mEFHD2-474;E:mEFHD2-308;:
∗P
<
输需要细胞骨架蛋白的参与[10-11]
。
紧密连接是构成血睾屏障的主要结构之一而
,
紧密连接有好几种蛋白构成有
,Occludin、ZO-1、
等成分[12]研究[13]显示敲除的
Claudin。,Occludin
小鼠出现了不同程度的生精障碍
。
结合细胞连接需要周期性的清除和形
Sertoli
成来维持正常的生精过程推测参与
,。EFHD2Ser-
细胞连接的周期性清除和生成对
toli。EFHD2Ser-
细胞内肌动蛋白和骨架蛋白的调节影响了
toli,Ser-
细胞的细胞连接的周期性开放从而影响生精细
toli,
胞的发育的正常存在对正常生精环境的
。EFHD2
维持起到了不可或缺的作用因此本研究观察
。EF-
在睾丸中的表达和定位实验结果验证了推
HD2,
测蛋白在睾丸中表达水平较一般组织要
,EFHD2
高且定位在支持细胞与细胞特异性蛋白
,(Sertoli
定位一致接着成功地进行了细胞
Vimentin)。TM4
图6Westernblot法检测siRNA干扰48h后的干扰检测蛋白和蛋白
各组EFHD2和Occludin的表达siRNA,OccludinEFHD2
一样呈下降趋势验证了在细胞层面和
阴性对照组组组,,EFHD2Oc-
A:;B:mEFHD2-731;C:mEFHD2-474;D:的合成是有关联的作为和紧
组空白对照组与阴性对照组比较∗∗∗∗P
mEFHD2-308;E:;:<cludin。OccludinBTB
密连接的蛋白成分和紧密连接对精子的发生
,BTB
又十分的重要那么在细胞的表达
,OccludinSertoli
的内吞和囊泡运输细胞连接的清除和形成减少将会影响精子的发生本研究明确了
,Sertoli。EFHD2
还依赖于细胞内吞作用和囊泡运输过程如通过细在小鼠睾丸中的定位及对细胞紧密连接蛋白
,Occlu-
胞内吞作用清除细胞连接处的连接蛋白可破坏细胞形成的影响阐明了蛋白维持细
din,EFHD2Sertoli
连接结构而连接蛋白随着囊泡运输重新与细胞膜胞的稳态起到了重要作用为继续研究在睾
;,EFHD2
融合可在该处形成新的细胞连接而内吞和囊泡运丸中的作用奠定了基础
。。
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2022Nov11·1749·
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proteinsinmouseSertolicells
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YeXiaolin,XuGuolin,QianTijun,QinFeng,WangYuntao,ChengYuhang,ZhaoWenzhen
1DeptofHistologyandEmbryology2InstituteofPathogensandVectorsSchoolofBasicMedicalSciences
(,,,
DaliUniversityDali3Grade2018ClinicalMedicineMajorofDaliUniversityDali
,671000;,671000)
AbstractObjective
TostudytheeffectofEFHD2proteindeletioninSertolicellsonOccludin,acomponentof
tightjunctionproteinandthelocalizationandexpressionofEF-handdomainfamilymemberD2(EFHD2)inmouse
Methods
‘sheart,liver,spleen,lung,kidney,
brainandtestistiss