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20227July2022
第卷第期
文章编号:()研究论文
1001-6325202207-1083-09
小鼠乳腺癌肺特异性转移细胞亚系的建立和验证
王子辕,段昭君∗,罗云萍∗
中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院免疫学系北京
(,100005)
摘要:目的筛选和建立乳腺癌的自发性高器官特异性转移亚系验证所建立的细胞亚系的细胞特征和肺转移器
,
官特异性方法利用实验性肺转移模型尾静脉注射小鼠乳腺癌细胞系回收肺转移灶细胞体外扩增培养
。,4T07,,
后再重复次获得高肺转移乳腺癌细胞再利用小鼠乳腺脂肪垫原位接种构建自发肺转移模型在此之间结合
,2,;;,
肺转移灶体外培养扩增重复次获得肺高转移细胞亚系及自发性肺转移模型转染筛选稳定表达荧光素酶的高
,3,;
转移细胞亚系显微镜下观察细胞形态学变化小动物活体成像和染色来检测肺特异性转移和体外迁移能力的
,;HE
变化流式细胞测量术分析原发灶转移灶及脾脏中免疫细胞的变化细胞划痕实验和小室法检测细胞
;、。Transwell
亚系的体外迁移能力的变化结果成功建立了小鼠乳腺癌肺特异性转移细胞亚系将稳定表达
。4T074T07LuM。
荧光素酶的细胞接种于小鼠乳腺脂肪垫后小动物活体成像结果发现荧光信号主要集中于肺器官
4T07LuM,,HE
切片可见肺脏中的肿瘤转移灶相较于亲本细胞体外迁移能力有明显提升的划痕闭合程度
。4T07LuM4T07,48h
是亲本细胞的倍P时迁移过小室的细胞数是亲本细胞的倍P细胞
(<),(<)。4T07LuM
荷瘤鼠的脾脏原位灶和转移器官的免疫细胞比例发生显著变化体内免疫微环境均更倾向于免疫抑制状态结
、,。
论实验性转移和自发性转移的连续筛选联合体外培养扩增可以建立高器官特异性转移的细胞亚系
。
关键词:乳腺癌肺转移器官特异性自发转移模型
;;;
中图分类号:文献标志码:
DOI:
.1001-
Establishmentandvalidationof
lung-specificmetastaticcellsublineofmousebreastcancer
∗∗
WANGZi-yuan,DUANZhao-jun,LUOYun-ping
(DepartmentofImmunology,InstituteofBasicMedicalSciencesCAMS,SchoolofBasicMedicinePUMC,Beijing100005,China)
AbstractObjective
:Toscreenandestablishaspontaneouslyhighorganotrophiccellsublineofmetastaticbreast
cancerandtovalidatecharacteristicandtheorganotropismofthelungmetastasiscellsublineobtainedfromthe
Methods
,mousebreastcancercellsline4T07wereinjected
invitro
;Byusingthespon-
invitro
taneousmetastasismodel,-
sioncultureoflungmetastasisandrepeatedthreetimes,alungorganotrophiccellsub-lineandmodelofspontane-
ouslungmetastasiswereobtained;Ahighlymetastaticcellsublinestablyexpressingluciferasewasobtainedby
invivo
收稿日期:修回日期:
2022-03-032022-04-27
基金项目:中央高校基本科研业务费专项资金
(3332020033)
∗通信作者(correspondingauthor):
******@;******@
基础医学与临床
(7)
performedtodetectthemigrationandlung-
immunecellsinprimarysite,
invitroResults
-specificmetastaticcellsubline(4T07LuM)
invivo
insitu
,accordingtotheresultsofTranswellandwoundhealingassays,
P
4T07LuM,comparedtotheparentalcells4T07,hadshownasignificantlymoreinvasivemigration(<).
Finally,accordingtotheresultsofflowcytometrydetection,4T07LuMcellhadshowedsignificantlyalteredtheim-
invivo
Conclusions
immuno--specificmetastasisabilityareobtained
invitro
throughcombinationofserialscreeningofexperimentalandspontaneousmetastasisandcultureexpansion.
Keywords
:breastcancer;lungmetastasis;organ-specificity;spontaneousmetastasismodel
乳腺癌是全球发病率最高的恶胞亚系并且通过转染筛选稳定表达
(breastcancer)4T07LuM,lucif-
性肿瘤高居全球女性癌病死率的首位[1]乳腺癌的和细胞来验证体内
,。erase4T07-luc4T07LuM-luc
转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因的乳转移能力以期为研究乳腺癌的肺转移机制提供合
,90%,
腺癌患者死亡可以归因于肿瘤的复发或转移[2][3]适的动物模型
。。
乳腺癌常见的转移器官包括骨肺肝脑和淋巴结
、、、1材料与方法
等其中肺脏被认为是乳腺癌转移的第二大常见部
,
位[4-5]
。
个月年总生存率仅为[6]肺转移严重实验动物与细胞系级周雌性的
22,%。:SPF6
影响了乳腺癌患者的预后小鼠中国医学科学院基础医学研究所实验
。Balb/c(
乳腺癌转移模型是探究转移嗜器官性分子机制动物中心小鼠乳腺癌细胞系美国斯克里普
);4T07(
的重要研究工具其按照建立方法可分为自发性转斯研究所实验室馈赠该动物研
。)。
移模型和实验性转移模型[7]现阶段的乳腺癌肺究经北京协和医学院伦理审查委员会审查和批准
。。
转移模型的亲本细胞来源主要集中于高转移细胞试剂公
:RPMI1640(BiologicalIndustries
系人源乳腺癌异种移植方面细胞司胎牛血清青霉素链霉素溶液
。,MDA-MB-231);%Trypsin、、-
系通过尾静脉注射的方法建立了实验性肺转移模和公司型胶原蛋白酶
Opti-MEM(Gibco);Ⅳ
型[8]鼠源乳腺癌同种移植方面目前已建立了公司TM
。,(ThermoFisherScientific);VivoGloLuciferin
和的原位肺转移模型[9-10]但属于和公司苏木精染料和伊红染
4T1-luc4T1,4T1D-luciferin(Promega);
高转移细胞系本身就存在着一定程度的肺转移筛料公司转染试剂
,,(ZSGB-BIO);Lipofectamine2000
选的过程只是将原有的肺转移特性放大因此这些公司助感染试剂
,(Invitrogen);Polybrene(Sigma-
模型均无法很好反应转移器官微环境对肿瘤细胞的公司
Aldrich)。
。4T07,
离开原发部位却不易形成明显的转移灶[11]荧光细胞培养细胞系亚系在
。:4T07/4T07LuM/
素酶常用于肿瘤研究中的生物发光成含有胎牛血清和青霉素链霉素的
(luciferase)10%100U/mL-
像当与底物结合时可以使转染的肿瘤细培养基中培养培养温度为气体
,luciferaseRPMI1640。37℃,
胞在体内发出生物光通过高灵敏度的光探测器进环境为空气湿度为饱和对于细胞
,5%CO2/95%,。
行成像后可以观察到肿瘤细胞的体内分布是探究传代用胰蛋白酶消化细胞并以
,,%-EDTA,
肿瘤发生和转移的常用成像方式[12]所以研究采的比例进行传代培养
。1∶3。
用作为亲本细胞构建乳腺癌肺特异性转移细实验性肺转移模型的筛选将处于对数增殖
:
王子辕小鼠乳腺癌肺特异性转移细胞亚系的建立和验证
1085
期的小鼠乳腺癌细胞用的胰蛋储存液至工作液将荷瘤小鼠放置于麻醉
%EDTAferin1×。
白酶消化制成6个细胞单细胞悬液每箱通入***麻醉腹腔注射工作液
,5×10/mL。。D-luciferin
只小鼠经尾静脉注射周后在后将小鼠放置于活体成像箱中
Balb/c100μL。2~3(10μL/g),10min
无菌条件下对小鼠进行***处理使用型胶原进行成像拍照并且记录数据
。Ⅳ,。
蛋白酶消化肺脏肿瘤转移灶并通过滤膜研石蜡包埋切片及苏木精和伊红染色检测肺
,
磨过滤肿瘤组织得到细胞悬浮液将其置于培养转移灶为了进一步探究荧光信号是否意
,。:luciferase
箱中培养后让细胞贴壁并更换新鲜的完全培味有肿瘤灶或病变的存在将原位接种和
,4h,,4T07-luc
养基体外扩增培养后将富集培养的细胞再次注细胞的小鼠的肺组织切片进行了
。,4T07LuM-lucHE
射到小鼠尾静脉重复上述筛选过程轮得到细胞染色将***的小鼠手术取出肺组织后立即放
,3,。,
亚系入多聚甲醛溶液中固定流水漂洗组织块
4T07lung-S3。4%2d。
自发性肺转移模型的筛选将6后使用梯度浓度的乙醇溶液脱水组织然后使用二
:100μL5×10,,
个细胞的细胞悬液接种到甲苯进行透明处理浸蜡后将组织整理包埋于石蜡
/mL4T07lung-S3Balb/c,
小鼠的第对乳腺脂肪垫中后对小鼠实施块中对包埋材料进行修整后固定在切片机上
4,35d。,,
***消化肺转移的细胞并进行体外扩增培养组织切片将切片于温水中展片并用载玻片
,。4μm,,
之后将富集培养的细胞接种到小鼠的第对乳腺从一侧捞片后放置于的烤片机上烤干
460℃。
脂肪垫中并再次重复自发转移筛选两轮得到细将石蜡包埋的切片浸入梯度浓度的乙醇中进行
,,
胞亚系脱蜡处理复水后依次用苏木精染色用盐酸乙醇
4T07LuM。。,,
细胞转染及稳转细胞系的构建进行分化用氨水漂洗返蓝脱水后再用伊红
:,,%
为了实时观察体内的转移情况本研究构建稳定表乙醇溶液复染在每张载玻片上滴一滴中性树脂
,。,
达的细胞系亚系和并分并覆盖盖玻片制好的玻片在显微镜下观察对核
luciferase/4T074T07LuM,。,
别标记为转染前将质深染的区域进行拍照统计
4T07-luc、4T07LuM-luc。1d。
细胞铺入孔板内待细胞汇合度达到左细胞划痕愈合实验和小室法检测
293T6,70%
右时进行转染将表达质粒和体外迁移和侵袭为了探究细胞体外迁移
。luciferasepLP1、:4T07LuM
和慢病毒穿梭质粒和辅助包装原和侵袭水平变化将和细胞接种于
pLP2pLP/VSVG,4T074T07LuM
件载体质粒按照分子质量计算用量总计孔板内每孔接种5个细胞每组个复孔
DNA,2μg24,5×10,3。
将稀释于培养待细胞汇合至时使用黄枪头在每个孔中沿小
DNA。2μgDNA100μLOpti-MEM90%,
基中混匀后静置同时将转染孔直径垂直划线然后给每个孔换液去除脱落的细
5min,2μLLipo2000,
试剂置于培养基中混匀后静置胞将孔中完全培养基换成含的培养基进
100μLOpti-MEM,1%FBS
将稀释液逐滴加入行培养内镜下观察孔内划痕宽度的变
5min。Lipofectamine2000DNA。0、24、48h
稀释液中混匀后静置再将转染工化每个孔内选取个独立视野进行拍照统计划痕
,20min。200μL,3,
作液加入培养液中混匀后置于培愈合比例
37℃,5%CO2。
养后换液后收取上清病毒孔板感重悬和细胞至6个在
,4~6h。48h,64T074T07LuM1×10/mL,
染细胞在不含双抗的完全培养基孔小室先铺的培养基中加的
4T07/4T07-LuM,24(1%FBS)200μL
中每孔加入病毒原液并添加的助感细胞悬液将小室悬挂于孔板中板孔加入
,1mL2μg/mL。24,
染试剂后换液感染病毒后的细胞增的完全培养基培养后将小
polybrene,6h。500μL10%FBS。12h,
殖汇合达到时更换为新鲜的含嘌呤霉素的培室从细胞板中取出清洗后多聚甲醛固定再
80%,,PBS,。
养基处理细胞直至未感染的空白对照组细胞全部次用清洗后将小室浸没于结晶紫染料中染
。PBS,
死亡后更换完全培养基进行扩大培养色染色结束后蒸馏水清洗并用棉签擦拭显微镜下
,。,,
小动物活体成像检测体内转移情况使用观察并统计迁移至小室膜外侧的细胞数
:。
配制的储存液工作流式细胞测量术分析免疫细胞浸润丰度为
PBS150mg/mLD-luciferin(10×:
液保存实验前使用稀释了探究小鼠体内免疫微环境的改变在安乐处死
),-80℃。,PBSD-luci-,
基础医学与临床
(7)
和荷瘤小鼠后使用酒精对肿瘤周件进行统计所有的统计分析都是用
4T074T07LuM,。GraphPad
围进行消毒取出小鼠的脾脏原位肿瘤和肺脏脾软件进行定量数据均采用双尾未配对的
,、,Prism8。、
脏直接置于基本培养基中研磨滤膜过滤细t检验两组进行分析数据均以平均值标准差
,70μm()。±
胞悬液原位肿瘤和肺脏切碎后加入型胶xs表示
;5mLⅣ(±)。
原酶工作液摇床消化滤膜过滤细胞悬
,2h,70μm2结果
液将上述的细胞悬液混匀离心后加入裂红液裂解
;,
,
悬即得到可用于上机检测的单细胞悬液细胞计数建流程
,
5个细胞离心后重悬向细胞亚系构建过程经由多轮体内筛
5×10,100μLPBS。100μL4T07LuM
的细胞悬液中加入抗体避光孵育选图先经过轮实验性转移筛选尾静脉接
1μL。4℃(1A)。3,
再次离心后弃去上清然后用洗涤细种5个细胞周后发现肺出现
30min,。PBS5×10/100μL4T07,2
胞次重悬细胞流式细胞仪上机检明显的肿瘤转移结节而肝脏和脾较为正常未发现
2,500μLPBS,,,
测免疫细胞浸润相对比例采用软件进行结有转移灶图将肺转移肿瘤细胞体外富集培
,FlowJo(1B)。
果统计养后得到细胞亚系然后进行自发性
。,4T07lung-S3。
,4
所有的图像数据都是采用软件进行统细胞左右消化肺脏中的肿瘤组
ImageJ4T07lung-S3,35d
计所有的细胞流式检测数据都是采用软织体外富集培养得到细胞
。FlowJo,4T07LuM。
;,liverandspleenofmice2
weeksaftertailveininoculation
图1小鼠乳腺癌肺转移细胞亚系(4T07LuM)的构建过程及流程图
Fig1Constructionprocessandflowchartofmousebreastcancerlungmetastasiscellsubline(4T07LuM)
王子辕小鼠乳腺癌肺特异性转移细胞亚系的建立和验证
1087
(3A)。,
筛选所得的镜下细胞形态学变化不分离出小鼠的各个器官检测肿瘤的转移情况心脏和
4T07LuM,
明显细胞贴壁增殖黏附排列大小较为一致细胞肺脏处能够检测出较强的荧光强度肝脏中只检测出
,,,,
形状呈现梭型和球型细胞边界明显细胞数量也没微弱的荧光强度图其余器官均无法检测出
,,(3B,C),
有发生明显变化图荧光信号证实具有肺特异性转移的能力
(2)。,4T07LuM。
与对照组相比组小鼠发与活体成像结果一致相较于组
4T07-luc,4T07LuM-luc,4T07,4T07LuM
图2显微镜下4T07LuM细胞形态
Fig24T07LuMmicroscopy-basedcellmorphology
insitu
;-lucmetastasisineachorganafter
insituinsitu
vaccination(totalimaging);-lucmetastasisineachorganafterinoculation(separateimaging)
图34T07LuM细胞的验证及体内成像结果
Fig3Constructionandinvivoimagingresultsof4T07LuMcells
基础医学与临床
(7)
组肺的染色结果可以观察到正常组织细胞周围出瘤细胞从原发部位进行扩散渗透进入循环系
HE,
现了异型性细胞核质深染胞核体积和核质比例增统然后外渗到远端转移器官并且完成定植乳
,,,。
大可观测到双核或多核细胞证实为肿瘤细胞图腺癌转移模型就是围绕各个转移步骤而建立的
,,(4)。
[7]现阶段研究集中于肿瘤自身
。
和两株细胞在时进对转移的影响目前广泛使用的人源性乳腺癌肺
4T074T07LuM0、24、48h,
行细胞划痕愈合检验图组的划痕转移模型细胞缺乏完整免疫
(5A),4T07LuMMDA-MB-231-LM2
愈合比例要明显高于组和时系统背景[13]而本研究筛选得到的
4T07,2448h。4T07LuM,
细胞的迁移能力分别是亲代细胞的优势在于可以接种具有完全免疫的小鼠更全面
4T07LuM4T07,
P和倍P此外与地反应免疫微环境对肿瘤转移的影响本研究
(<)(<)。,。
相比迁移过小室的结晶紫染色细胞发现原位接种细胞后正向杀伤肿瘤
4T07,4T07LuM4T07LuM,
数量显著提高图细胞的迁移能力的免疫细胞浸润减少而促进肿瘤生长转移发
(5B),4T07LuM,、
是亲代细胞的倍P挥免疫抑制作用的免疫细胞浸润增多肿瘤和肺
(<)。,
。
抑制状态本研究一致的是原位灶和远处转移器官的免疫
,
原位接种细胞后相较于亲代细胞环境都影响肿瘤转移的进程转移性肿瘤相比原
4T07LuM,,
免疫微环境也发生了一定程度的改变脾脏发性肿瘤具有更低的免疫原性[14]而且肺作为
4T07,。,
中+和+细胞比例明显降低PP远处转移器官接受肿瘤定植需要高度依赖免疫
CD4CD8T(<,<
图原位灶中和细胞的比例明显抑制的微环境[15]细胞模型将免疫系
)(6A),M2B。4T07LuM
上调PP图肺转移灶中+和统引入到转移级联中可以探究早期原位灶的肿
(<,<)(6B),CD4,
+细胞比例也明显降低PP图瘤细胞如何逃脱免疫监视进入循环系统以及如
CD8T(<,<)(,
何塑造远处转移器官的免疫抑制微环境并形成
6C)。,
易于肿瘤定植的转移前生态位
3讨论。
目前乳腺癌转移的治疗效果不佳部分原因是
,
乳腺癌转移是个复杂多级联的过程需要肿缺乏预测方法来确定患者哪些器官容易发生转移
,,
图44T07/4T07LuM细胞原位接种后肺的HE染色
Fig4HEstainingoflungafter4T07/4T07LuMcellsinoculationinsitu(×40;×100;×200)
王子辕小鼠乳腺癌肺特异性转移细胞亚系的建立和验证
1089
∗P
(×40);(×100);<,
∗∗P
<
图54T07/4T07LuM细胞体外细胞迁移实验
Fig5Cellmigrationassayof4T07/4T07LuMcellsinvitro(x±s,n=3)
故亟需器官特异性转移模型的基础研究为预防治基因由于细胞同时具备了肺特异性和
。4T07LuM
疗提供新靶点本研究利用细胞几乎无法高转移性的特点测序比较两株细胞系和
。4T07,4T07
形成转移灶的细胞特性在接受多轮肺脏微环境可以寻找影响肺转移的新型生物标志
,4T07LuM
驯化后它的体外侵袭和迁移能力都显著增强物为乳腺癌转移的临床诊断提供更丰富的依据
“”,,,
进一步的体内实验结果又显示出其肺转移的特异和更准确的治疗策略
。
性即肺脏高度转移的同时却在其他器官很少观此外本研究仍存在一些局限性例如
,,4T07LuM
察到转移灶的形成相较于高转移的细胞原细胞作为小鼠乳腺癌细胞系无法同基因工程模型
。4T1,
位肺转移模型细胞体现出微环境对肺小鼠一样地准确探究肿瘤休眠机制而且乳腺癌的
,4T07LuM,
转移的影响更容易富集到肺特异性转移的关键异质性和临床转化的复杂性限制了该模型的应用
,。
基础医学与临床
(7)
++
;;
++
;(A-C)statisticalresultsofimmunecellinfiltration;
∗P∗∗P∗∗∗P
<,<,<
图64T07/4T07LuM脾脏、原位和转移灶的部分免疫细胞浸润情况
Fig6Partialimmunecellsinfiltrationof4T07/4T07LuMcellsinspleen,intumorimmunemicroenvironment
andmetastasis(x±s,n=5)
综上所述本研究建立了来自低转移细胞系分离出验证了细胞肺特异性转移细胞亚系为临
,4T07LuM,
器官特异性的高转移细胞亚系的一般方法构建并床转移癌的研究提供了新实验模型
,。
参考文献:
etal
[1]SungH,FerlayJ,SiegelRL,.GlobalcancerCACancerJClin,2021,71:209-249.
statistics2020:GLOBOCANestimatesofincidenceand[2]ChafferCL,
mortalityworldwidefor36cancersin185countries[J].metastasis[J].Science,2011,331:1559-1564.
王子辕小鼠乳腺癌肺特异性转移细胞亚系的建立和验证
1091
[3]RiggioAI,VarleyKE,[J].JVisExp,2016,
ofmetastaticrecurrenceinbreastcancer[J].BrJCancer,114::.
2021,124:13-26.[10]GuoW,ZhangS,-
etal
[4]LiangY,ZhangH,SongX,.Metastatichetero-ge-topicmodelofbreastcancermetastasistothelung[J].
neityofbreastcancer:molecularmechanismandpotentialOncolRep,2015,33:2992-2998.
therapeutictargets