文档介绍：肝炎病毒的常见检测手段
刘颖
乙型肝炎病毒
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus )是指引起人类急、慢性肝炎的DNA病毒,也称丹氏颗粒,简称HBV。
我国的乙肝病毒感染率约60%-70%;%,以此计算,全国约有9300万人携带乙肝病毒,其中乙肝患者大约有3000万
乙型肝炎病毒(HBV) 属嗜肝DNA 病毒科(hepadnaviridae), ,为部分双链环状DNA。HBV 的抵抗力较强,但65℃10 小时、煮沸10 分钟或高压蒸气均可灭活HBV。含氯制剂、环氧乙烷、戊二醛、过氧乙酸和碘伏等也有较好的灭活效果
肝炎病毒的分类
肝炎病毒是医学术语,指引起病毒性肝炎的病原体。人类肝炎病毒有甲型、乙型、丙型、丁型和戊型和庚型病毒之分。甲型肝炎病毒呈球形,无包膜,核酸为单链RNA。乙型肝炎病毒呈球形,具有双层外壳结构,外层相当一般病毒的包膜,核酸为双链DNA。除乙型肝炎病毒遗传物质为双链DNA外,其他类型病毒均为单链RNA。除了甲型和戊型病毒为通过肠道感染外,其他类型病毒均通过密切接触、血液和注射方式传播。
乙肝病毒基因
目前,已可从感染HBV病人的血清中及感染肝脏提纯的病毒核心中分离出环状双股DNA,从而确定HBV属DNA病毒。目前,由于克隆化DNA完整核苷酸已经确定,现已证实HBsAg和HBcAg都是由Dana颗粒的DNA所编码,并且二类基因存在同一DNA分子上。有人比较病毒基因编码能力和病毒多少,发现HBV DNA负链能编码全部已知的HBV蛋白质,而其正链开放读码区,不能编码病毒蛋白。HBVDNA负链有四个开放区,分别称为S、C、P及X,能编码全部已知的HBV蛋白质。S区可分为二部分,S基因和前S基因。S基因能编码主要表面蛋白。S基因之前是一个能编码163个氨基酸的前S基因,编码Pre S1和Pre S2蛋白。C区基因包括前C基因和C基因,分别编码HBeAg和HBcAg。P区最长,约占基因组75%以上,编码病毒体DNA多聚酶。X区可能编码有154个氨基酸的碱性多肽。
乙肝的抗原
HBV的抗原有3种:表面抗原(HBsAg)、核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)。表面抗原大量存在于感染者血液中,是HBV感染以及检测的主要标志。它具有抗原性,可诱导机体产生特异保护性的抗-HBs,也是制备疫苗的最主要成分。
核心抗原由183个或185个氨基酸组成,高度磷酸化,是乙肝病毒核心颗粒的唯一结构蛋白。正由于它存在于Dane颗粒核心结构表面,被表面抗原覆盖,故不易在血循环中检出。核心抗原具有强免疫原性,可诱导很强的体液免疫和细胞免疫,刺激机体产生抗-HBc。
e抗原为可溶性蛋白质,传染性强,游离存在于血液中,虽然很早就被发现,在病理上认为是HBV复制以具有强感染性的一个指标,但其功能尚不清楚。抗-HBe的出现,是预后良好的征象。
常见的检测方法
PCR/RT-PCR:荧光定量、杂交、芯片等
酶联: ELSA、化学发光等
侧向层析:胶体金、乳胶等
聚合酶链式反应(PCR)
聚合酶链式反应(PCR)过程利用模板变性,引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA序列。这是一个指数增长的过程,因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板,使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。一般,经过20-30个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到
RT-PCR是在此基础上通过探针作为示踪标记物建立起来的方法,能够完成实时的定量分析工作。
基于乙肝病毒基因检查的方法主要有:荧光PCR法、竞争PCR法、PCR酶联免疫吸附法、荧光标记物法和PCR酶联化学发光等方法。这些方法各有优缺点,所使用的仪器设备、试剂品质源于不同的国家和地区,设立的标准曲线以及标准荧光等各不相同,得出的数值左右漂浮,偏差很大,得出的检测值范围也不相同。
HBV-DNA检测则是采用聚合酶链式反应(PCR)技术,特异性扩增乙肝病毒基因组保守的C基因区上270bp基因片段,以近于2n的指数(n为循环次数),在数小时内可将极微量的HBV-DNA特定的分子片断扩增至1x107~1x108倍,大大提高了HBV的检出率,为临床诊断是否为HBV感染提供了一种强有力的手段。
ELSA
ELISA方法一直是临床诊断HBV感染的传统手段,反映机体HBV感染的免疫状态。
化学发光是基于ELISA基础上通过改变检测系统建立的新方法。