文档介绍：2016级研究生细胞生物学实验讲义
一、原代细胞培养
内容:
实验所需(每组):
小鼠3只,75%酒精1瓶,大烧杯一个,饭盒1个(内有:大剪刀1把,大镊子1个,眼科剪刀2把,眼科镊子2把),一次性培养皿2个,PBS液(含双抗)50ml,DF12培养基(含15%血清)10ml,15ml离心管1个,5ml注射器1个,移液器一套(1000ul、200ul、10ul),灭菌Tip头一套(1000ul、200ul、10ul),血细胞计数板1个,计数板专用盖玻片2个,。
实验方法:
1、高压消毒取材用器材:剪刀(包括眼科剪)数把、镊子(包括眼科镊子)数把。
2、断颈处死小鼠,无菌条件下分离双侧股骨和胫骨,在含PBS的平皿中去除股骨周围肌肉组织,剪去包括骺板在内的两侧骺端,暴露骨髓腔。
3、用5ml注射器以PBS反复冲洗骨髓腔直至发白,反复吹打骨髓细胞悬液,制成单细胞悬液,1000rpm离心10分钟。
4、弃上清,适量培养基重悬,细胞计数,种植密度为1-2x106/ml于
25cm2培养瓶,将培养瓶放于370C,5%CO2孵箱进行培养,此即为0代。48小时后观察换液。待细胞呈80-90%汇合时,进行消化传代。
二、细胞的浸润与转移:
内容:
实验所需(每组):
贴壁培养在24孔板中的肿瘤细胞,细胞浸润实验24孔板专用的transwell(孔径6-8um、单个装),%明胶1ml,24孔板1个,PBS液(含双抗)50ml,%胰酶10ml,肿瘤细胞培养基20ml,血清3ml,15ml离心管2个,移液器一套
(1000ul、200ul、10ul),灭菌Tip头一套(1000ul、200ul、10ul),,棉棒1包,结晶紫染液1ml。
实验方法:
用无菌200ul tip头在培养有肿瘤细胞的24孔板中轻轻划一道直线(划掉细胞为准),更换无血清培养基,培养24小时后观察。
2. transwell实验
1)%明胶包被。
2)将具有侵袭能力的肿瘤细胞胰酶消化,无血清培养液重悬。
3)24孔板每孔下室中加入含10% 血清(作为趋化剂)的培养液;上室中立即加入无血清培养液重悬的细胞悬液。
4)将24孔板放入培养箱中常规培养。24小时后以无菌棉棒轻轻揩去上室残留细胞后,用4%的多聚甲醛固定上室底面的细胞,室温放置10min。蒸馏水洗涤。
5)蒸馏水洗去固定液后,结晶紫染色10 min。蒸馏水冲洗后观察。
三、细胞转染
内容:
miRNA的细胞转染
实验所需(每组):联系好荧光显微镜。
荧光标记的miRNA、脂质体2000、贴壁培养在24孔板中的肿瘤细胞, EP管,PBS液(含双抗)50ml,无血清无抗生素转染专用Opti-MEM 培养液5ml,移液器一套(1000ul、200ul、10ul),灭菌Tip头一套(1000ul、200ul、10ul),。
实验方法:(按照每孔计算)
-MEM 培养液25