文档介绍：DNA琼脂糖凝胶电泳
一、简介
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多,应用非常广泛,它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点,已成为分离和鉴定核酸的常用方法。
二、实验材料
质粒DNA、基因组DNA或它们的酶切产物、琼脂糖、溴化乙锭(EB)、上样缓冲液、TAE电泳缓冲液(Tris(三羟***氨基甲烷), NaAc, EDTA)。
三、实验原理
~,核酸分***基几乎不解离,磷酸全部解离,核酸分子带负电,在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物,在分子筛的作用下,使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异,从而能达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料(如EB)后,在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
四、实验步骤
1. 称取1g琼脂糖,加入到100ml TAE中,在微波炉中加热使琼脂糖颗粒完全溶解,冷却至50-60oC时,加入4μl EB溶液(可以不加),轻轻摇晃,混匀。
2. 待凝胶液冷至50oC左右时,倒入凝胶槽,凝胶厚度一般为5~8mm。
3. 在凝胶槽中放入梳子,注意调节好梳子之间的距离。
4. 待凝胶成形后,小心拔出梳子,用刀片将凝胶与凝胶槽之间小心地分离,小心取出凝胶,放入盛有电泳缓冲液的电泳槽中。若电泳缓冲液不足,可加入适量电泳缓冲液,使电泳缓冲液液面高出凝胶2~3mm。
5. 用移液枪取5μl待测DNA样品,与上样缓冲液混合均匀,小心地加入到凝胶上样孔中。
6. 打开电泳仪,插好导线,电压110V(有时100V),电泳20min。也可根据指示染料移动的位置,确定电泳是否终止。
7. 电泳完成后切断电源,取出凝胶,置于紫外透射仪上观察电泳结果,并照相记录。
五、注意事项
1. 影响DN***段琼脂糖电泳的几个因素:
(1)DNA分子的大小:线性DNA分子的迁移率与其分子量的对数值成反比。
(2)琼脂糖浓度:一定大小的DN***段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。相反,在一定浓度的琼脂糖凝胶中,不同大小的DN***段的迁移率也是不同的。若要有效地分离不同大小的DNA,应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。
(3)DNA构象:一般迁移速率超螺旋环状DNA>线状DNA>单链开环DNA。当条件变化时,情况会相反,还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及
EB含量有关。
(4)电流强度:每厘米凝胶电压不超过5V