文档介绍：PCR基因扩增
(6学时,4小时30分钟)
一、实验目的:通过本实验学****PCR反应的基本原理与实验技术。
二、实验原理:聚合酶链反应的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DN***段两侧和与其两侧相互补的两个寡核苷酸引物,经变性、退火、延伸若干循环后,DNA扩增2n倍。反应体系:DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2 、两个合成的DNA引物,耐热Taq聚合酶。包括高温变性(94oC)、低温退火(50o- 60oC)、中温延伸(72oC)三个阶段。
三、仪器、材料、试剂:
、移液枪
(正向引物和反向引物)
10. ×TBE 11. 10×PCR buffer 12. loading buffer
四、实验步骤:
,设计引物。
:
dNTP混合物 2μl
10×PCR buffer
正向引物 1μl
反向引物 1μl
模板DNA
Taq聚合酶
双蒸水
,设计PCR程序,进行扩增。(编辑程序:79、80、81、82、83,使用PCR仪上的编辑键option—edit—enter—store--home)
(1) 94 oC 预变性 5min
(2) 94 oC 变性 30s
(3) 55 oC 退火 30s
(4) 72 oC 延伸 1min
(5) 重复步骤(2)、(3)、(4) 30次
(6) 72 oC 总延伸5min
制备1%琼脂糖凝胶,25μlPCR产物+10μl loading buffer,点5-7个孔。第一个孔点3μl Maker,后5-6个孔各点6μl产物,50V电泳90min。(可以根据情况点样)。
5. 电泳完毕,关上电源,取出凝胶,在染色室紫外透射仪下观察结果。(注意要带上手套,不要把有机玻璃内槽拿到染色室)
五、实验结果:
基因存在处显示出橘红色荧光条带。
六、分析讨论:
?
答:DNA自然复制是在体内进行的,不需要经热循环,复制和解旋是同时进行
的,属于半保留复制,有解旋酶等多种酶共同参与,引物是RNA,复制结
束后要被切掉。而PCR扩增则是在体外进行的,用的是热变性的方法使DNA双链解开,先解旋后复制,使用的是耐热的Taq酶,引物是DNA。
?有什么意义?
答:因为该实验使用的是热循环法,最高温度达94 oC。一般的聚合酶在该温度
下已失活,Taq是耐热的DNA聚合酶,发现于水生栖热菌内,生存于温泉、蒸汽管道处的细菌,Taq酶耐90 oC以上的高温而不失活。在发现Taq酶之前,每次做PCR,每个循环需要加一次聚合酶,非常麻烦。发现Taq酶后,使PCR反应变的简单,得以推广,成为生物医学领域一项革命性创举和里程碑。
3. 在自然温度下,加入解旋酶,能否完全模拟体内环境实现PCR反应?