文档介绍：PCR扩增和扩增产物克隆
PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应):(1) 变性(Denature):目的双链DN***段在94℃下解链;(2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸
(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106倍。
详细
实验方法
实验材料
? 模板DNA
试剂、试剂盒
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? KCl Tris·Cl Triton X-100 MgCl2 dNTP Taq DNA聚合酶 T4 DNA连接酶 pUC质粒矿物油琼脂糖 TBE 无水乙醇 70%乙醇酚***仿异戊醇
仪器、耗材
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? 移液器移液器吸头 PCR小管 DNA扩增仪电泳槽
电泳仪
? 台式高速离心机?
PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应):(1) 变性(Denature):目的双链DN***段在94℃下解链;(2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):
在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。
一、 PCR反应中的主要成份
1、引物:PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则:(1) 引物长度约为16-30bp, 太短会降低退火温度影响引物与模板配对,从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。(2) 引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm=4(G+C)+2(A+T)。(3) 四种碱基应随机分布,在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。(4) 引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对。(5) 在引物内, 尤其在3'端应不存在二级结构。(6) 两引物之间尤其在3'端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。(7) 引物5'端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、***等。通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。(8) 引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。(9) 简并引物应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
-。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算:
X mol/L= OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
X: 引物摩尔浓度,A、C、G、T:引物中4种不同碱基个数。
2、4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP):dNTP应用NaOH ,并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装,-20℃贮存。
一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。理论上4 种 dNTP各20μmol/L,。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq ,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。
3、 Mg2+:Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退