文档介绍：PCR扩增技术
PCR是一种选择性体外扩增DNA或RN***段的方法。其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。所谓引物就是与待扩增DN***段两翼互补的寡核苷酸,其本质是ssDN***段。待扩增DNA模板加热变形后。两引物分别与两条DNA的两翼序列特异复性。此时,两引物的3’端相对,5’端相背。在合适条件下,由TAP(或其他)DNA聚合酶催化引物引导的DNA的合成,即引物的延伸。上述过程是由温度控制的。这种热变性—复性—延伸的过程就是一个PCR循环。PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。延伸的产物经第二循环变性后,亦与引物互补。作为引物引导DNA合成的新模板。因此,第二循环后,延伸的模板由第一循环的4条增加为8条(包括原始模板在内),以此类推,以后每一循环后的模板均比前一循环增加一倍。理论上讲,扩增DNA产量是指数上升的,即ng个循环后,产量为2n拷贝。图中明显指明了扩增片段的末端是由两引物5’端限定的。
图中所示的前3个循环是完整的。从第四个循环开始,图中未示出的原始模板DNA的归宿。需注意的是,较两引物限定区长的延伸产物仅能发生在以原始模板DNA为模板的扩增产物中,所以,这种扩增产物每一循环后仅增加2条,其扩增量为2n,即30个循环后才增加至60条单链,电泳是根本无法发现如此微量的DNA。相反,较短的引物限定的DNA扩增片段出现于第二循环,以后每一循环都比前一循环增加一倍,并很快成为主要的扩增产物。30个循环后扩增量为230拷贝,约109个拷贝。
二,典型的PCR操作
在此处仅列出一般PCR操作过程,具体各种影响因素的优化在后续章节讨论,每一具体操作前都需进行必要的优化。
(一) 试剂
(1) 引物:根据待扩增DNA不同,引物亦不同,引物的设计见本章第三节。
(2) 耐热DNA聚合酶:此酶是从耐热细菌中分离出来的。能耐受高温(93~100℃),
不同耐热DNA聚合酶的特性详见本章第四节。
(3) 10*PCR缓冲液:500mmol/L KCL;100mmol/L Tris-HCl( , 20℃),150mmol/l
MgCl2,1mmol/l明胶。
(4) 5mmol/l dNTP贮备液:将dATP,dCTP,dGTPT,dTTP钠盐各100mg合并,加3ml
灭菌去离子水溶液,用NaOH调PH至中性,分装每份300ul,-20℃保存。dNTP
浓度最好用UV吸收法精确测定。
(5) 标本处理试剂:不同标本所需试剂不同,根据具体情况而定。
(二) 操作程序
利用PCR扩增的操作程序基本相同,只是根据引物与靶序列的不同,选择不同的反应体系与循环参数条件(见第二节)。