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溶菌酶的提取和系列性质测定
实验报告
学院:生物科学与工程学院
班级:
姓名:
学号:
组别:第七组
组员:
二、实验原理:
1蛋白质提取分离技术
以蛋白质和结构与功能为基础,从分子水平上认识生命现象,已经成为现代生物学发展的主要方向,研究蛋白质,首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识,但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别,把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中,如盐析,有机溶剂提取,层析和结晶等;二是将混合物置于单一物相中,通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的,如电泳,超速离心,超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性,防止酸、硷、高温,剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段:选择材料和预处理,细胞的破碎及细胞器的分离,提取和纯化,浓细、干燥和保存。
微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料,所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物,应注意它的生长期,在微生物的对数生长期,酶和核酸的含量较高,可以获得高产量,以微生物为材料时有两种情况:(1)得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等;(2)利用菌体含有的生化物质,如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳,脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同,其中所含生物大分子的量变化很大,另外与季节性关系密切。对动物组织,必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料,先进行绞碎、脱脂等处理。另外,对预处理好的材料,若不立即进行实验,应冷冻保存,对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。
柱层析技术也称柱色谱技术。一根柱子里先填充不溶性基质形成固定相,将蛋白质混合样品加到柱子上后用特别的溶剂洗脱,溶剂组成流
动相。在样品从柱子上洗脱下来的过程中,根据蛋白质混合物中各组分在固定向和流动相中的分配系数不同经过多次反复分配,将不同蛋白组分逐一分离。
根据填充基质和样品分配交换原理不同,离子交换层析,凝胶过滤层析和亲和层析是三种分离蛋白质的经典层析技术。
3电泳技术
聚丙烯酰***凝胶电泳是网状结构,具有分子筛效应,它具有两种形式,一种是非变性聚丙烯酰***凝胶,蛋白质在电泳中保持完整的状态,蛋白在其中依三种因素分开:蛋白大小,形状和电荷。
而SDS-PAGE仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。这个技术首先是1967年由shapiro建立,他们发现在样品介质和丙烯酰***凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽视。
SDS是阴离子去污剂,作为变性剂和助溶试剂,它能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇,二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后,分子被解聚成多肽链,解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量,这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统,于连续缓冲系统相比,能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用,凝胶浓度较小,孔径较大,把较稀的样品加在浓缩胶上,经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液,电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后,HCL解离成***离子,甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷,因此一起向正极移动,其中***离子最快,甘氨酸根离子最慢,蛋白居中。电泳开始时***离子泳动率最大,超过蛋白,因此在后面形成低电导区,而电场强度与低电导区成反比,因而产生较高的电
场强度,使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动,形成以稳定的界面,使蛋白聚集在移动界面附近,浓缩成一中间层。
此鉴定方法中,蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量,而与所带电荷和分子形状无关。
具体实验内容
一、实验目的
1、提取鸡蛋清中的溶菌酶
2、测定蛋白质浓度
3、测定溶菌酶的酶活力
二、实验仪器及材料
1、仪器:柱层析系统(层析柱,恒流泵,紫外监测仪,部分收集器),Sigma高速冷冻离心机,722s分光光度计,透析袋,水浴锅,电泳仪,电泳槽,紫外凝胶成像系统,移液枪(1000ml,200ml,100ml),烧杯,玻璃棒,容量瓶,移液管,洗耳球,
2、材料:新鲜鸡蛋。
3、试剂:
(1)弱酸性阳离子交换树脂;(2)磷酸氢二钠;(3)磷酸二氢钠;(4)***化钠;(5)硫酸铵;(6)氢氧化钠;(7)甘油;(8)盐酸;(9)葡聚糖凝胶G-50;(10)溶壁微球菌干粉;(11)考马斯亮蓝G-250;(12)95%乙醇;(13)85%磷酸;(14)牛血清清蛋白(BSA);(15)脲;(16)丙烯酰***(Acr);(17)甲叉双丙烯酰***(Bis);(18)四***乙二***(TEMED);(19)甘氨酸(Gly);(20)过硫酸铵(AP);(21)考马斯亮蓝R-250;(22)三羟***氨基甲烷(Tris);(23)2-β-巯基乙醇;(24)十二烷基磺酸钠(SDS);(25)溴酚蓝;(26)冰醋酸;(27)
标准蛋白:SDS-低相对分子质量标准蛋白.
4、试剂配制
(1),;
(2);200ml
(3);200ml
(4)含50%,;200ml,现配。
(5),;现配。
(6),;现配。
(7),;现配。
(8)测活缓冲液:含30mmol/,;现配。
(9)底物溶液Ⅰ:40mg溶壁微球菌干粉溶于100mL测活缓冲液中;现配,公用。
(10)考马斯亮蓝G-250试剂:考马斯亮蓝G-250100mg溶于50mL95%乙醇中,加入100mL85%磷酸,用蒸馏水稀释至1000mL,滤纸过滤;公用。
(11)标准蛋白质溶液:/L磷酸盐缓冲液,;公用。
(12)底物溶液Ⅱ:300mg溶壁微球菌干粉溶于100ml测活缓冲液中;(生物技术班不用配制)。
(13)10mol/L脲,测活缓冲液配制;(生物技术班不用配制)。
(14)30%胶贮液:每100mL中含丙烯酰***,甲叉双丙烯酰***;
(15)-;购买,不用配。
(16)-;购买,不用配。
(17)10%(W/V)过硫酸铵;现配。
(18)SDS电泳缓冲液:25mmol/LTris,,%(W/V)SDS;
(19)10%(W/V)SDS;公用。
(20)染色液:-250,42mL工业酒精,10mL冰醋酸,加蒸馏水至50mL;
(21)脱色液:5mL冰醋酸,45mL工业酒精,50mL蒸馏水;100ml
(22)保存液:7%冰醋酸;现配。
(23)2×上样缓冲液:购买,不用配。
-
甘油2mL
20%SDS2mL
%
2-β-
三:实验步骤
1酶的提取
(一)样品的制备:
新鲜鸡蛋四个,破蛋壳取出蛋清,(),搅拌均匀,(NaOH调pH),然后用八层纱布过滤,留取上清液,量取体积并记录,(定为Ⅰ步骤样品)-20℃冻存备用。
(二)阳离子交换层析
:,水洗至中性,,水洗至中性。
:,。
:在已平衡好的阳离子交换树脂中加入蛋清样品,搅拌吸附1h(玻璃棒搅拌)。
:倒去其余上清液,,。
:将树脂搅拌均匀装入离子交换柱,
,。(装柱前,先检查层析柱是否干净,保证所有接头密闭、管道通畅;装柱时,流速不超过3mL/min,全过程绝对不能出现流干现象)。
:/L磷酸盐缓冲液,,合并光吸收高峰管,量取体积并记录,,-20℃冻存备用(定为Ⅱ步骤样品)。
(三)硫酸铵沉淀
每100mL上清液中缓慢加入35g硫酸铵固体,溶解后静置30min,10000rpm离心10min,,,,-20℃冻存备用(定为Ⅲ步骤样品)。
四注意事项
,层析柱要达到平衡。
。
(四)实验数据
图1酶提取仪器稳定图