文档介绍：实验十五、SDS-聚丙烯酰***凝胶电泳
一、概述
蛋白质的聚丙烯酰***凝胶电泳(PAGE)是蛋白质分析过程中最常用的技术,通常在电泳分离时,其迁移率主要取决于蛋白质本身所带的电荷多少、分子量大小和形态。但如在PAGE中加入阴离子去污剂SDS, SDS将蛋白质的二硫键、氢键及梳水键打开,使蛋白质变性, SDS将包裹在变性蛋白表面,使蛋白质成为刚性分子;同时,由于SDS带有大量负电荷,使蛋白质本身带有的电荷可忽略。至此情况下,不同蛋白质分子的迁移率主要决定于带有的SDS量,即蛋白质分子的大小。因此利用SDS-PAGE可测定蛋白质的分子量。
二、试剂
丙烯酰***和甲叉双丙烯酰***单体溶液(Acr和Bis) 称取丙烯酰***30g,甲叉双丙烯酰***,加水至100ml,过滤后存于棕色瓶中,于4℃保存。
4X分离胶缓冲液称取Tris ,加入10%SDS贮备液4ml,用12mol/L HCl调pH至8,8,定容至100ml。
4X浓缩胶缓冲液称取Tris ,加入10%SDS 4ml,用l2mol/L ,定容至100ml。
10%,加水至5ml。本储存液应现配现用。
10X电极缓冲液称取Tris 30g、甘氨酸144g,加入10%SDSl00ml,定容至1000ml。
2X样品缓冲液称取蔗糖2g(或甘油2m1),加入10% SDS 2ml,,、β-,加水定容至10ml。
染色液称取考马斯亮蓝R-250 ,加入甲醇450ml,冰乙酸l00ml、水650ml。
脱色液甲醇100ml,冰乙酸100ml,加水800m1.
三、操作步骤
1、分离胶的制备
(1). 根据所分离的蛋白质分子量选择分离胶的浓度,制备不同浓度的凝胶所需的储备液可参考下表,、10cm X 7cm的凝胶。在配制凝胶时,将水、30%Acr和Bis储液、4X分离胶储液混合完全后,真空脱气5分钟,然后加入过硫酸***和TEMED,立即准备灌制凝胶。
(2). 将混合液充分混合后,缓慢地倒入已经固定在夹心垂直平板电泳槽里的狭槽中,注意在本操作过程中不能产生任何气泡。然后尽快地在分离胶的上面轻轻地覆盖一层水。
(3). 置于室温下15-30分钟,使凝胶聚合完全(在水相和凝胶的交界处有一明显的亮线)。除去上层水相,然后再用水或浓缩胶缓冲液(-HCI,, %SDS) 洗凝胶表面,准备灌制浓缩胶。
不同浓度凝胶的制备
成
份
不同浓度所需的储备液体积
%
10%
%
15%
%
H20
30% Acr和Bis分离胶
4X缓冲液
10% 过硫酸铵
TEMED
112 u1
5 ul
112 ul
5 ul
112 ul
5 ul
112 ul
5 ul
112ul
5ul
2. 浓缩胶制备的方法
(1). 将丙烯酰***和甲叉双丙烯酰***,浓缩胶缓冲液888