大肠杆菌感受态细胞制备及转化.ppt

文档介绍：大肠杆菌感受态细胞制备及转化
实验目的
掌握制备和保存大肠杆菌感受态细胞的方法
掌握转化的方法技术
了解转化过程中各因素对转化率的影响
感受态及转化实验原理
定义
petence):细菌处于容易吸收外源DNA 的状态
转化(transformation):异源DNA分子导入受体细胞的过程
致敏过程: 用理化方法诱导细胞进入感受态的操作
在生长周期的任何时刻自动产生感受态;(. 枯草杆菌)
在生长周期的特定时刻产生感受态;( .大肠杆菌)
细菌产生感受态的类型
受体菌与质粒的选择
受体菌:
DH5α:无Ap抗性
外源质粒
Ampr抗性基因编码一种周质酶(β-内酰胺酶)可特异地切割Amp的β-内酰胺环,从而使其失去杀菌能力
选择:
如进行蓝白斑筛选时可选用DH5α、JM109 、 TG1 ;
用T7启动子进行原核表达时可选用BL21(DE3);
制备感受态细胞方法
原生质体法
电击法
特殊试剂诱导法:CaCl2诱导法
+
质粒DNA
420C热击
复苏
Amp+
细菌处于00C,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,
外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面,
经短时间420C热击处理,促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放在非选择性培养基上保温一段时间,使抗氨苄青霉素的表型表达后
再转到含氨苄青霉素的选择性培养基上,长出来的菌即为转入了外源基因的菌株。
转化率定义及计算
公式:
转化子数/ug DNA =
单菌落数
质粒浓度(ng/ul) X 1uL

X10x1000
影响转化效率的因素
细菌的生长状态:大肠杆菌在对数中期易产生感受态
OD值:- (5X107个/ml)
试剂的质量:
化合物及无机离子:Rb+、Mn+、二甲亚砜等
质粒:大小、构型
外源DNA(质粒)与细胞的比例:
器皿的洁净度
污染—尽量所有打开器皿盖的操作都在超净台中进行
感受态细胞的保存
制备好的感受态细胞每100uL分装一支EP管
轻轻混匀----可以用tip头轻轻搅匀.
4℃保存(不加甘油),可保存一周;
加30%甘油,-20 ℃保存,可保存一月;
加30%甘油, 80 ℃保存,可保存六月;