文档介绍：免疫学实验指导
实验一免疫球蛋白的粗提(盐析法)
一、实验目的
1、
2、
3、学****免疫球蛋白的粗提方法实践IgG分离纯化过程了解分离纯化抗体的原理
二、实验原理
随着免疫学的发展和需要,免疫球蛋白的纯化和其成分的提纯成为必不可少的手段。纯化的方法很多,有单一法,常用盐析法、凝胶柱层析、离子交换剂层析以及免疫亲和层析等技术对血清抗体进行分离纯化。但大多数采用二步法以上相结合的方法,特别是以硫酸铵提纯为基础,再经过透析或层析柱的方法来提高免疫球蛋白及其各成分的纯度最为常用。硫酸铵溶液能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷而使之沉淀下来(称为盐析)。不同浓度的硫酸铵盐析蛋白成分不同,利用这一原理提取所需的免疫球蛋白成分。盐析只能粗提,为了获得纯化的免疫球蛋白成分,必须进一步采用层析的方法进行分离。
水膜与同性电荷的排斥作用是蛋白质胶体稳定的基础,在蛋白质胶体溶液中加入一定量的(NH4)2SO4或Na2SO4盐类,使溶液中大部分自由水分子转变为离子水化分子,降低蛋白质极性基团与水分子的相互作用,破坏蛋白质水膜,蛋白质溶解度也随之降低。蛋白质由于分子质量和携带
的电荷不同,可在不同浓度的高盐溶液内分级析出。33% (NH4)2SO4为沉淀IgG的最适饱和度。
二、实验材料与试剂配制
(购买商品)
硫酸铵 800g~850g
H2O 1 000ml
加热至绝大部分溶质溶解为止,趁热过滤,置室温过夜,然后以28%(不调pH值也可以)。
注:硫酸铵以质量优者为佳,因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属,可在溶液中通入H2S,静置过夜后滤过,加热蒸发H2S即可。
PBS液
A液: NaH2PO4液
NaH2PO4·2H2O
加H2O至 1 000ml
B液: Na2HPO4液
Na2HPO4·12H2O
加H2O至1 000ml
取A液19ml,B液81ml加水至1 000ml即可。
Mol/ Mol/L的NaOH液
三、实验步骤
1、取免疫血清 ,加 生理盐水/PBS
2、逐滴加入饱和(NH4)(此时为50%饱和度),4℃,静置 20 min,2SO4 mL
3000 r/min 离心 20 min
3、弃上清,取沉淀溶于1 mL 生理盐水/PBS中
4、逐滴加入饱和(NH4)2SO4 mL(此时为33%饱和度),4℃,静置 20 min,3000 r/min 离心 20 min
5. 重复步骤3~4,2次
6. mL 生理盐水中,-20摄氏度保存备用
四、注意事项
1、盐析时注意饱和硫酸铵加入血清中的速度和方式,边加边缓慢摇动,并避免产生气泡。
2、注意区别前后2次盐析所采用的饱和硫酸铵的终浓度。
五、实验报告
1、记录实验步骤结果
2、思考题:分离纯化IgG时,为什么硫酸铵的饱和度先调至50%,然后调至33%?加入硫酸