文档介绍：实时定量 P C R 技术 Real time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR
微生物131 沈涛
基本原理:
在RT-qPCR中,对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号,随着反应时间的进行,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。
在PCR反应早期,产生荧光的水平不能与背景明显地区别,而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期。RT-qPCR可行性定量是在PCR扩增的指数期进行的。首先需设定一定荧光信号的域值,一般这个域值是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
域值
→
Ct
↑
常规PCR vs RT-qPCR
常规PCR:借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析
RT-qPCR:利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,最终精确的对起始模板的定量分析
定量PCR三个基本概念
扩增曲线
指数增长期
平台期
线性增长期
背景期
阈值:是循环开始3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,设定在扩增曲线指数增长期
C(t)值:荧光信号(扩增产物)到达阈值时所经过的扩增循环次数
Threshold line
C(t) value
C(t) value
+/
-
Threshold line
C(t) value
C(t) value
+/
-
C(t) value
+/
-
C(t) value
+/
-
化学反应原理
依据反应中所选荧光物质的不同,实时荧光定量PCR的化学反应原理通常分为荧光染料和荧光探针两种:
1、SYBR荧光染料:
SYBR是一种与双链DNA小沟结合的染料。在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料, SYBR荧光染料特异性掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
2、TaqMan荧光探针:该探针是一种寡核苷酸探针。
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,两端分别标记一个荧光基团和一个淬灭基团。当探针与靶序列配对时,荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使荧光基团和淬灭基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
SYBR Green I法
结合双链DNA分子小沟
延伸结束,形成双链DNA,SYBR Green结合到双螺旋小沟中,当受到适合光源激发,发射出荧光,反映产物浓度
优点
使用方便,无需复杂的设计
成本较低
缺点
与非特异性产物结合,无模板特异性
试验方法较难优化
灵敏度低
TaqMan探针法
水解型
报告基团,淬灭基团
FRET(荧光谐振能量传递)
识别特异性产物
优点
特异性高,可准确定量
灵敏度高
设计不同标记的探针,可进行多重检测
缺点
一个探针只适用于一个目标
价格较高
探针设计较繁琐
两种化学的比较