文档介绍：第五章 核酸的分离与检测
一、核酸的分离、提取通则
核酸在细胞中通常与各种蛋白质结合在一起。
分离原则:保证核酸分子一级结构的完整性;排除其他分子污染。
分离与纯化的方法一般包括细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。
1. 细胞裂解
机械作用:低渗、超声、微波、冻融裂解和颗粒破碎等。不适于高分子量长链核酸的分离。
化学作用:一定p H 和变性条件下,细胞破裂,蛋白变性沉淀,核酸→水相。变性条件:加热、表面活性剂(SDS、Triton X-100 、Tween 20 、NP-40 等) 、强离子剂(异硫***酸胍、盐酸胍等) 。p H 环境:强碱(NaOH) 或缓冲液( TE、STE 等)。金属离子螯合剂( EDTA 等) 螯合Mg2+ 、Ca2+,抑制核酸酶活性。
酶作用:溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶)破裂细胞。降解与核酸结合的蛋白质,促进核酸的分离。
联合使用:细胞、待分离核酸类型及后续实验目。
2. 酶处理
裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K 或链酶蛋白酶) ,降解蛋白质;灭活核酸酶(DNase 和RNase)
加入DNase 和RNase 去除不需要的核酸。
防止核酸的降解和变性
防止过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏(一般在
pH 4-10下进行) ;
避免剧烈搅拌;
防止核酸酶(DNase , RNase )的作用。
抑制DNase:
可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂;或加去污剂十二烷基硫酸钠(SDS);或加蛋白变性剂。
抑制RNase:
实验器皿高温,或高压灭菌,不能高压灭菌的用
%二乙基焦碳酸盐(diethyl
pyrocarbonate, DEPC)处理。
加强的蛋白变性剂如硫***酸胍、异硫***酸胍等。
加核糖核酸酶阻抑蛋白(RNasin)等RNase的抑
制剂。
质粒DNA的提取——碱裂解法
溶液I:50 mM葡萄糖, 25 ,10 mM EDTA,pH —— Tris-Cl→ pH;葡萄糖→大肠杆菌悬浮;EDTA →金属离子螯合剂。
溶液II: N NaOH , 1% SDS——NaOH →碱裂解细胞,控制时间,温柔混合; SDS →结合蛋白。
溶液III:3 M 醋酸钾, 2 M 醋酸——醋酸钾→PDS沉淀;醋酸→中和碱。
3. 核酸的分离与纯化
高电荷磷酸骨架比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性。
根据理化性质差异,选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法。
①酚提取/ 沉淀法
经典方法是酚:***仿抽提法。
裂解细胞;离心分离含核酸水相;等体积酚:***仿:异戊醇(25 :24 :1 体积) 混合液抽提,漩涡振荡混匀(小分子量核酸) /颠倒混匀(高分子量核酸) ,离心分离;疏水性的蛋白质→有机相,核酸→上层水相。
缓冲液饱和酚——蛋白变性;***仿增加有机相比重,防止酚流入水相;异戊醇可减少操作过程中产生的气泡,下层的界面更清晰。
核酸盐经有机溶剂沉淀浓缩
酚、***仿抽提后用乙醇沉淀
水相加p H5. 0~5. 5,终浓度0. 3M NaAc 或KAc (钠离子中和核酸磷酸骨架负电荷,在酸性环境中促进核酸疏水复性),加2~2. 5 倍体积乙醇,沉淀核酸。
离心收集, 70 %乙醇漂洗核酸沉淀除盐分。
其他可用于沉淀核酸的有机溶剂: 异丙醇、聚乙二醇( PEG) 等;盐类:10. 0mol/ L 醋酸铵、8. 0mol/ L 的***化锂、***化镁和低浓度的***化锌等。