文档介绍：凝集素芯片使用说明
材料目录
1、芯片凝集素点阵
2、凝集素芯片保存方法
3、凝集素芯片使用方法
4、所需试剂及其配置方法
5、凝集素亲和性表
一
芯片上各个凝集素点阵
□ AAL BPL DSL DBA ECL
AAL BPL DSL DBA ECL
? EEL HHL Jacalin LTL MAL
ΠΠ EEL HHL Jacalin LTL MAL
? MPL NPL WBA EBL STL
MPL NPL WBA EBL STL
? SBA UEA WGA SWGA WFL
SBA UEA WGA SWGA WFL
? ? ? ? ?
说明:1、□是荧光位置标记位点,作为坐标
2、每个凝集素重复两个点。
二、凝集素芯片保存方法
将凝集素芯片放在芯片盒内(注意不要互相接触),放入4℃冰箱冷藏,可保持3-6个月。
三、凝集素芯片使用方法
(一) 对细胞的检测
细胞系细胞提取
取对数生长期的细胞,倾去培养液,%胶原酶Ⅳ(D-hank's),37 ℃消化1 h,每隔10 min吹打一次。1500r/min离心5 min,收集沉淀。PBS洗涤2次,重悬备用(注:用胶原酶主要是怕损伤细胞膜糖链结构,如果没有,常规细胞培养的胰蛋白酶也可)
如果对细胞进行荧光标记,在重悬后的细胞液中加入50-100ul的吖啶橙溶液,轻摇5min后PBS洗涤两次,重悬备用。
体液细胞悬液的制备
胸腔积液、腹水等1500r/min离心5min后,倾倒上清液。按1:3的比例向细胞沉淀中加入ELS裂解液去除红细胞,轻轻吹打混匀。1500 r/min离心5 min,收集沉淀。PBS洗涤2次,重悬后进行细胞计数(1×10—1×10)。取少许上述细胞悬液,孵育到凝集素芯片上46
(如需荧光标记,重复上面荧光标记步骤)。
组织细胞提取
取动物组织,用肝素D-hank's液清洗后剪碎,%胶原酶Ⅳ(D-hank's),37℃消化1h,每隔10min吹打一次。1500r/min离心5min,按1:3的比例向细胞沉淀中加入ELS裂解液去除红细胞,轻轻吹打混匀。1500 r/min离心5 min,收集沉淀。RPMI 1640洗涤2次,重悬备用。
凝集素芯片孵育
取出备用的凝集素芯片,于37℃湿盒内水化30 min,%酪蛋白溶液(PB, mol/L, PH=)封闭5 min,PB缓冲液(,pH=)洗涤15 min,将细胞悬液滴加到芯片上,覆盖住凝集素芯片矩阵,常温或者37 ℃孵育40 min,PBS缓冲液(pH )洗涤,3%戊二醛(PBS,pH )固定2 min(如不染色,固定一步可以省略)。
凝集素芯片捕获细胞的检测
荧光标记的检测
激光扫描仪扫描整个芯片
常规P巴氏染色(Papanicolaou’s stain),观察捕获细胞位点,显微镜下观察(注:PE染色后吖啶橙荧光消失)。
对蛋白的检测
芯片准备处理同前
检测方法
1、蛋白直接荧光标记,扫描检测
2、蛋白捕获后,加荧光二抗孵育,扫描检测
3、蛋白孵育后,加其他标记的二抗检测